z-diser 070401

Диссертация

Автореферат

Доклад

ЕСЛИ ЭТОТ ТЕКСТ ОСКОРБИТ ЧЬИ-ТО РЕЛИГИОЗНЫЕ ЧУВСТВА, ПРОСТИТЕ - Я ЭТОГО НЕ ХОТЕЛ.

 


ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ И ТРОПИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ ИМ. Е.И. МАРЦИНОВСКОГО

_______________________________________________________________

На правах рукописи

 

РАСНИЦЫН

Сергей Павлович

ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ПЕРЕНОСЧИКОВ И ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МАЛЯРИИ

Специальность: 03.00.09 - Энтомология

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА - 1997

"Сказать можно все,

а ты поди, демонстрируй."

Д.И. Менделеев.

Оглавление.

ВВЕДЕНИЕ

Гл.  1. КОНЦЕПЦИЯ МЕДИЦИНСКОЙ ЭНТОМОЛОГИИ

Гл.  2. ТЕРМИНЫ, МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ

2.1. Термины

2.2. Материалы

2.3. Методы

2.4. Математическая обработка результатов

Гл.  3. ЭНТОМОЛОГИЧЕСКАЯ БАЗА ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Принципы культивирования переносчиков

3.2. Выбор индикаторов и способ оценки сходства

3.3. Получение биоматериала

3.4. Создание и поддержание колоний комаров

3.5. Некоторые стороны биологии комаров, имеющие прямое отношение к передаче возбудителей болезней человека

Гл.  4. ОЦЕНКА МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ЗАРАЖЕННОСТИ ПЕРЕНОСЧИКОВ

4.1. Оценка наличия возбудителей, их обилия и количества крови, выпи­той комаром

4.2. Влияние способа кормления переносчиков кровью на их заражаемость возбудителями

4.3. Влияние порядка кормления переносчиков на доноре на их заражае­мость возбудителями

4.4. Влияние обилия возбудителей на заражаемость переносчиков

Гл. 5. СВЯЗЬ ВОСПРИИМЧИВОСТИ С ТАКСОНОМИЧЕСКИМ И ГЕОГРАФИЧЕСКИМ ПОЛОЖЕНИЕМ ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ ОРГАНИЗМОВ

5.1. Восприимчивость переносчиков к экзотическим штаммам возбудителей

5.2. Адаптация возбудителя к переносчику

5.3. Восприимчивость без коэволюции

5.3. Сравнение восприимчивости разных видов

5.4. Обзор данных о восприимчивости комаров России и сопредельных стран к экзотическим видам и штаммам плазмодиев

Заключение главы 5

Гл.  6. ИНДИВИДУАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВОСПРИИМЧИВОСТИ

6.1. Распределение возбудителей среди переносчиков

6.2. Наследование восприимчивости

Заключение главы 6

Гл. 7. ВЛИЯНИЕ ЭНДОГЕННЫХ ФАКТОРОВ НА ВОСПРИИМЧИВОСТЬ ПЕРЕНОСЧИКОВ

Гл. 8. ВЛИЯНИЕ ПИТАНИЯ ПЕРЕНОСЧИКОВ НА ИХ ВОСПРИИМЧИВОСТЬ

8.1. Необходимость углеводов

8.2. Влияние количества выпитой крови

Заключение главы 8

Гл. 9. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ РАЗВИТИЯ НА ВОСПРИИМЧИВОСТЬ ПЕРЕНОСЧИКОВ

Гл. 10.  ВЛИЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ВОСПРИИМЧИВОСТЬ ПЕРЕНОС­ЧИКОВ

Гл. 11. ПРЯМОЕ ВЛИЯНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ НА ПЕРЕНОСЧИКОВ

11.1. Влияние возбудителей на чувствительность переносчиков к инсекти­цидам

11.2. Влияние возбудителей на летные способности переносчиков

11.3. Влияние возбудителей на агрессивность переносчиков

11.4. Влияние возбудителей на продолжительность жизни переносчиков

11.5. Влияние возбудителей на плодовитость переносчиков

Заключение гл. 11

Гл. 12. КОСВЕННОЕ ВЛИЯНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ НА ПЕРЕНОСЧИКОВ

12.1. Влияние возбудителей на привлекательность хозяев для переносчиков

12.2. Влияние возбудителей на защищенность хозяев от переносчиков

Заключение гл. 12

Гл. 13. СОХРАНЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ В ПЕРЕНОСЧИКАХ

13.1. Влияние биологически активных веществ на сохранение возбудителей в переносчиках

13.2. Влияние повторного кровососания на сохранение возбудителей в переносчиках

Заключение гл. 13

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА


ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Отношения членистоногих с возбудителями болезней позвоночных, в частности, комаров с плазмодиями малярии - специфический вариант симбиоза, закономерности которого выявлены только для крупных таксономических категорий (Павловский, 1939; Беклемишев, 1948, 1949, 1955; Алексеев, 1984а, б, 1985; Балашов, 1984). Об отношениях видов, популяций и отдельных особей до начала наших работ имелись лишь отрывочные противоречивые данные. Такое положение не позволяло предвидеть, в каких случаях комары способны быть переносчиками малярии и как влияют плазмодии на их жизнедеятельность.

Ликвидировать малярию в мире не удалось (Sharma, 1988; Peters, 1988; Najera, 1989), и опасность ее завоза на освобожденные территории сохраняется (Сергиев и др., 1966; Немировская, 1969; Ambroise-Thomas et al., 1972; de Zulueta, 1973; Schultz, 1974; Чагин и др., 1975, 1976; Дашкова и др., 1978; Орлов, 1987; Духанина, Баранова, 1989). Поиск ответов на поставленные вопросы актуален и в сугубо практическом плане. Во-первых, оно позволяет определять, в каких случаях комары могут распространять необычные для них виды и штаммы плазмодиев. Во вторых, недостаток данных о жизнедеятельности зараженных переносчиков не позволяет предпринимать полностью адекватных мер по защите от них.

Поскольку изучение отношений возбудителей и переносчиков невозможно без лабораторного эксперимента, актуальной проблемой является получение материала для исследований - культивирование комаров.

Цель и задачи исследования. Цель работы - определить характер отношений переносчиков и возбудителей малярии.

Для достижения поставленной цели потребовалось решить следующие задачи:

- определить место исследования отношений возбудителей и переносчиков в круге проблем медицинской энтомологии;

- выявить те аспекты биологии комаров, знание которых необходимо для создания и поддержания их культур и для определения их отношений с плазмодиями малярии;

- разработать методы получения энтомологического материала и получить его;

- создать лабораторную модель циркуляции плазмодиев, включающую реальных переносчиков малярии человека;

- подобрать методы заражения переносчиков;

- определить точность методов оценки обилия возбудителя в хозяине и переносчике;

- выявить факторы, определяющие возможность и уровень заражения переносчиков возбудителями;

- определить влияние возбудителей на состояние и поведение переносчиков;

- определить возможности сохранения возбудителей в переносчиках.

Научная новизна.

1. Предложена концепция медицинской энтомологии, согласно которой задача этой науки - исследование влияния членистоногих на здоровье людей и управления этим влиянием.

2. Разработаны теоретические основы культивирования членистоногих: 

- обеспечение безопасности путем использования моделей и экзотических видов;

- отказ от воссоздания природной обстановки, а обеспечение условий, необходимых и достаточных для воспроизводства биоматериала;

- создание градиента условий;

- оценка качества биоматериала по его стабильности и однородности;

- оптимизация культур путем снижения стоимости биоматериала при сохранении его качества и уровня производства;

- соблюдение этических норм в обращении с лабораторными животными.

3. Решен ряд общебиологических вопросов:

- разработаны принципы и методы выбора морфофизиологических индикаторов;

- разработана методология использования таксономического анализа для экологических исследований;

- показано, что эффект группы состоит из эффекта численности и эффекта концентрации особей;

- открыт "эффект приглашения" - неизвестный ранее стимул привлечения к добыче кровососущих двукрылых;

- дана оценка эффективности звуковых генераторов, предназначенных для отпугивания кровососущих двукрылых, и выявлены её причины.

4. Выявлены закономерности определяющие возможность и уровень заражения комаров возбудителями малярии:

- на уровне родов и видов отсутствует связь между систематическим положением возбудителей и переносчиков;

- восприимчивость может существовать без контакта взаимодействующих организмов;

- восприимчивость - свойство, наследуемое на уровне особей;

- восприимчивость подвержена влиянию эндогенных факторов и внешних воздействий.

5. Доказано, что плазмодии не оказывают существенного прямого влияния на важнейшие стороны жизнедеятельности комаров (чувствительность к инсектициду, полет, агрессивность, продолжительность жизни, плодовитость) и, потому, должны считаться не паразитами, а комменсалами комаров.

6. Доказано наличие косвенного влияния возбудителей на переносчиков. Оно состоит в том, что возбудитель облегчает переносчикам доступ к добыче.

7. Разработан математический метод оценки разных путей передачи для сохранения популяции возбудителя.

8. Предложен и обоснован набор принципов культивирования членистоногих:

- обеспечение безопасности путем использования моделей и местных видов;

- создание условий, необходимых и достаточных для жизни и размножения объекта, а не воспроизведение природной обстановки;

- предоставление особям градиента условий;

- оценка качества биоматериала по его стабильности и однородности, а не по сходству с природными особями;

- оптимизация культур путем снижения стоимости биоматериала при сохранении его качества и уровня производства;

- гуманное отношение к лабораторным животными.

Новизна результатов имеет мировой приоритет, о чем свидетельствует публикация их описаний в ведущих изданиях (Бюллетень Всемирной Организации Здравоохранения, Журнал общей биологии, Зоологический журнал, Известия РАН, Медицинская паразитология и паразитарные болезни, Паразитология, Экология, Энтомологическое обозрение), включение их в Руководство по медицинской энтомологии и получение авторских свидетельств об изобретении.

Практическая ценность.

1. Разработаны новые и усовершенствованы известные методы создания и поддержания культур комаров - базы для экспериментального изучения их экологии, отношений с возбудителям болезней и средств уничтожения.

2. Создана лабораторная модель циркуляции возбудителя малярии, которая сочетает безопасность с использованием реальных переносчиков малярии человека.

3. Отработан метод заражения комаров плазмодиями малярии путем искусственного кормления кровью.

4. Определена точность методов оценки обилия плазмодиев в крови позвоночных и в теле переносчиков.

5. Разработан метод оценки восприимчивости комаров к возбудителям малярии.

6. Определена возможность распространения на территории России и сопредельных государств экзотических видов и штаммов малярии.

7. Обоснована возможность использования в эпидемиологических моделях малярии данных о состоянии и поведении незараженных особей переносчика.

Внедрение результатов  исследования  в практику.

1. В  Институте  Медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского (ИМПиТМ) создан инсектарий - база для экспериментального изучения экологии комаров, их отношений с возбудителями болезней и средств уничтожения.

2. Воспроизведены и созданы заново культуры 10 видов комаров, в том числе 3 впервые в мире. Они переданы в инсектарий ИМПиТМ.

3. Методы культивирования комаров изложены в 4 инструкциях, утверж­денных директором ИМПиТМ, в 19 публикациях, в описаниях 5 изобретений и 17 рационализаторских предложений. Эти методы используются в ИМПиТМ; с ними были ознакомлены многочисленные отечественные и зарубежные исследователи, посещавшие ИМПиТМ и обучавшиеся на рабочем месте.

4. Метод культивирования комаров Culex pipiens внедрен в ВНИИ Прикладной микробиологии и на Бердском химическом заводе.

5. За время исследований (до создания общеинститутского инсектария) произведено 2138 партий комаров 10 видов (более 5,4 миллиона особей), которые использованы для выполнения НИР в нескольких подразделениях ИМПиТМ и 22 организациях в 11 городах, и были переданы в Болгарию и Вьетнам.

6. Лабораторная модель циркуляции возбудителя малярии и метод определения восприимчивости комаров к возбудителям малярии используются в ИМПиТМ.

7. Материалы диссертации используются в теоретической и практической подготовке курсантов Российской Медицинской Академии последипломного образования.

Внедрение работ в практику подтверждено соответствующими актами, приведенными в приложении.


Положения, выносимые на защиту.

1. Принадлежность членистоногого к определенной таксономической группе не свидетельствует о том, что оно восприимчиво к определенной группе возбудителей, а лишь о том, что эту восприимчивость нельзя исключить без проверки. Внутри семейства Culicidae нет жесткой связи между таксономическим положением комаров и их восприимчивостью к возбудителям малярии.

2. Плазмодии малярии могут использовать комаров в качестве переносчиков без длительного периода предварительной взаимной адаптации.

2. Восприимчивость - количественное свойство, зависящее от индивидуальной наследственности, условий развития, внешних воздействий, количества выпитой крови и эндогенной ритмики жизни особи.

3. Уровень заражения комаров не зависит от повторного кровососания и потребления углеводов и (после превышения минимальной заражающей дозы) не имеет четкой связи с обилием заглоченных плазмодиев.

4. Плазмодии не оказывают существенного прямого влияния на важнейшие стороны жизнедеятельности комаров и, потому, должны считаться не паразитами, а комменсалами комаров.

5. Возбудители малярии оказывают на комаров косвенное влияние, повышая для них возможность обнаружения и доступность позвоночных хозяев.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 5-ом совещании Всесоюзного энтомологического общества (1963), совещании "Актуальные вопросы изучения и освоения таежных территорий." (1963), 6-ом съезде Всесоюзного энтомологического общества (1970), 13-ом международном энтомологическом конгрессе (1971), заседаниях Московского общества испытателей природы (1975, 1980), Всесоюзной конференции "Теория классификации и анализ данных" (1981), 7-ом съезде Всесоюзного микробиологического общества (1985), Всесоюзной конференции "Пути повышения эффективности микробиологической борьбы с вредителями и болезнями растений" (1986), I-ом Всесоюзном совещании по проблемам зоокультуры (1986), I-ой научно-практической конференции "Здоровье населения России и пути его улучшения" (1994), заседаниях Московского общества эпидемиологов и микробиологов им. И.И. Мечникова (1988, 1991), Первой и Второй Всесоюзных конференциях по промышленному разведению насекомых (1986, 1989), Ученом Совете ИМПИТМ (1994), коллоквиумах отдела медицинской энтомологии ИМПИТМ (по несколько раз ежегодно).

Публикации. Результаты работы отражены в 76 публикациях, а также в описаниях 17 рационализаторских предложений.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 261 странице маши­нописного текста и состоит из введения, 13 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 481 источник, из которых 236 отечественных и 245 иностранных авторов, и приложения. Работа иллюстрирована 82 таблицами и 17 рисунками.

Благодарности. В первую очередь благодарю Кружок юных биологов зоопарка, Е.С. Смирнова и В.Н. Беклемишева, научившим меня относится к науке не как набору знаний, а как полю деятельности. Глубокая и искренная признательность директорам ИМПиТМ П.Г.Сергиеву, Ф.Ф.Сопрунову, В.П.Сергиеву, М.Н.Лебедевой  и  заведующим  отделом  мед.  энтомологии  А.Н.Алексееву  и Л.А.Ганушкиной за поддержку данного направления.

Большое спасибо С.А.Рабинович за то, что дала P.gallinaceum, и М.И.Букатиной за обучение работе с ним.

Всегда буду помнить и ценить помощь сотрудников: Т.Л.Абрамовой, Р.Г.Абрашкина-Жучкова, А.Н.Бикуновой, Л.М.Витлина, А.А.Войцика, Н.Г.Дашковой, В.Т.Деминой, А.Н.Егоровой, А.Н.Жаровой, В.В.Жерихина, А.Б.Званцова, Л.А.Казанцева,  А.Г.Креславского,  Н.Н.Лебедевой, А.С.Матяж, А.Н.Опариной, Е.В.Сыроечковского, Г.А. Шевелевой, В.В.Ясюкевича, работавших со мной дни и ночи в поле и в лаборатории.


Глава. 1. КОНЦЕПЦИЯ МЕДИЦИНСКОЙ ЭНТОМОЛОГИИ.

 

До последнего времени энтомологи, как правило, не занимались изучением отношений возбудителей и переносчиков, поскольку данная проблема, казалось, лежит вне этой науки, ведь согласно определению: "Медицинская энтомология изучает членистоногих, вредящих здоровью человека. Вредить здоровью человека членистоногие могут тремя способами: как паразиты человека, как переносчики болезней и как ядовитые животные" (Беклемишев, 1949, стр. 139). Это определение повторяется во всех энциклопедиях, учебниках и руководствах вплоть до самых последних (Дербенева-Ухова, 1974; Заречная, 1975; Биологический энциклопедический словарь, 1986; Тарасов, 1996). Следуя такому определению, работа медицинских энтомологов сосредоточились на изучении тех видов, вредоносность которых установлена, в плане, традиционном для энтомологии: систематика, фаунистика, экология, этология и т.п.

Благодаря успехам, достигнутым медицинской энтомологией в прошлом, в настоящее время она может выйти на новый, более высокий уровень, который удовлетворит современные запросы теории и практики. Дело в том, что членистоногие могут оказывать не только вредное, но и оздоровительное влияние. Надо учитывать их как факторов комфорта, аллергизаторов, источников лекарственных средств и т.п. Но, самое главное, мы не только сейчас, но и в принципе не можем предусмотреть все аспекты действия членистоногих на здоровье людей; это - проблема, открытая до тех пор, пока люди и членистоногие сосуществуют.

Пришло время расширить понимание медицинской энтомологии. Целесообразно принять следующее определение: "Медицинская энтомология" - наука, изучающая влияние членистоногих на состояние человека и способы управления этим влиянием (Расницын, 1996, 1997). При таком подходе виды членистоногих (объекты изучения) выступают не как заданный набор, а как результат специальных исследований, достигнутый к определенному моменту времени. Медицинская энтомология в старом смысле слова ("изучение членистоногих") становится необходимой составной частью, но не как единственное занятие и, тем более, не как цель, а как одно из средств. Законное место в медицинской энтомологии получает использование членистоногих для охраны здоровья людей и разработка способов защиты от их вредоносного действия, в том числе, и в качестве переносчиков болезней. Согласно предложенной концепции медицинский энтомолог, не только "имеет право" на изучение отношений возбудителей и переносчиков, но эта проблема (ввиду важности трансмиссивных инфекций) является для него одной из главных. Профессия исследователя сказывается на подходе к вопросу и истолковании результатов. Энтомологический подход позволил обнаружить в отношениях переносчиков и возбудителей то, на что иные специалисты не обращали внимания.

К началу наших работ проблема возбудителей и переносчиков выглядела решенной. Была установлена связь между систематическим положением возбудителей и переносчиков (Беклемишев, 1948); классифицированы типы переноса (Беклемишев, 1949, 1955); сформулировано учение о природной очаговости (Павловский, 1939). Позднее была выявлена роль морфофизиологических особенностей кровососущих членистоногих в передаче возбудителей инфекций (Балашов, 1984) и, наконец, все это увенчала "Теория связи типов питания и пищеварения кровососущих членистоногих с их способностью быть специфическими переносчиками возбудителей трансмиссивных инфекций" (Алексеев, 1984а, б, 1985), которая объясняла восприимчивость фундаментальными свойствами крупных таксонов: семейств, отрядов, классов и выше. Поскольку было признано, что восприимчивость формируется в процессе длительной коэволюции взаимодействующих организмов, это свойство считалось неизменным. Лишь много позже, обнаружив, что оно зависит от внешних воздействий, проф. А.Н. Алексеев опубликовал специальную работу: "Экспериментальные доказательство возможности управления векторной способностью переносчиков плазмодиев малярии" (Алексеев, Ганушкина, 1988). Вопрос о влиянии возбудителя на переносчика также не вызывал сомнений. Микроорганизм однозначно считался вредоносным для макроорганизма (Бибикова, Бгытова, 1968), их сочетание именовалось "паразитарной парой", их набор - "паразитокосмосом" (Алексеев, 1989). Существование возбудителя считалось возможным лишь за счет круговорота между членистоногими и позвоночными хозяевами (Павловский, 1940). Задача дальнейших исследований, виделась лишь в том, чтобы отыскивать новые виды, уточнять их распространение и экологию (Петрищева, 1967).

Все сказанное относится и к малярии.  С тех пор,  как Р.  Росс (Ross, 1910) открыл роль комаров в переносе плазмодиев, исследования отношений между этими организмами, казалось, исчерпали проблему. Странным было лишь одно: несмотря на уверенность в патогенности плазмодиев для комаров, эпидемиология малярии молчаливо исходила из идентичности "здоровых" и "зараженных" особей (Мошковский, 1950; Macdonald, 1957; Rogers, 1988; Anderson, May, Gupta, 1989; Zoyza et al., 1991). Я думал, что дело в отсутствии количественных данных, и поначалу хотел лишь восполнить этот пробел. Оказалось, однако, что проблем гораздо больше, пришлось заняться и ими. Позднее стали появляться работы (они указаны по ходу изложения), посвященные тем же вопросам. Изучение отношений возбудителей и переносчиков малярии вновь стало актуальным (Sinden et al., 1989).


Глава. 2. ТЕРМИНЫ, МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ.

 

2.1. Термины.

При выборе терминов я ориентировался на предложенные В.Н. Беклемишевым (1959, 1961), В.Д. Степнюком и В.П. Литвиным (1976) и В.В. Кучеруком с Б. Росицким (1984), а также изданиями ВОЗ: "Терминология по малярии и ликвидации малярии" (1964) и "Биология малярийных паразитов" (1988). Необходимые уточнения приведены ниже.

Для краткости все организмы, способные вызвать болезнь человека, именуются "возбудители"; все позвоночные, в которых живут возбудители, именуются "хозяева", а все членистоногие, в которых живут возбудители, - "переносчики".

Всегда, когда не оговорено особо, имеется в виду "специфический перенос". С тех пор, как В.Н. Беклемишев (1945) дал определение этому термину, он оброс массой уточнений и интерпретаций (Павловский, 1947; Крючечников, 1983; Алексеев, 1984; Korenberg, Kryuchechnikov, 1986). В данном тексте перенос называется "специфическим" тогда и только тогда, когда возбудитель использует переносчика и как среду обитания, и как источник пищи. Комары и плазмодии - образец таких отношений; механически передача невозможна (McCarthy, 1975).

"Дозой возбудителя" называется число макрогаметоцитов в порции крови, которую комар выпил за один раз (число микрогаметоцитов по отношению к числу макрогаметоцитов всегда избыточно).

Термин "восприимчивость" употребляется как характеристика свойств потенциального переносчика. В англоязычной литературе это свойство именуют "susceptibility", что в русском издании "Терминология по малярии и ликвидации малярии" (1964) переведено как "чувствительность". Но термин "чувствительность" преокупирован - он используется для обозначения податливости членистоногих действию инсектицидов. В медицинской энтомологии, где изучение переносчиков и борьба с ними идут рука об руку, употребление одного и того же слова для обозначения этих разных понятий может привести к путанице.

Термин "зараженность" используется для обозначения наличия и обилия возбудителя в переносчике. Зараженность зависит от восприимчивости и от факторов, действующих на (или через) возбудителя. Таких как обилие возбудителя, внешние условия и т. п. а "восприимчивость" - от свойств особей (а через особей популяций и видов, которые они составляют), таких как строение, биохимия пищеварения, состав гемолимфы, размеры, возраст, и факторов, влияющих на эти свойства, таких как действие биологически активных веществ и т. п.

Строго говоря, термин "восприимчивость" неудачен. Правильнее было бы сказать "пригодность". Дело в том, что возникновение ксено-пар (т.е. эффективного сочетания возбудителя и переносчика) происходит в одностороннем порядке - путем отбора штаммов микроорганизмов, способных использовать определенные виды и популяции макроорганизмов. Нет никаких фактических данных, как нет и теоретических оснований для того, чтобы предполагать, будто в естественных условиях может идти отбор штаммов и, соответственно, популяций членистоногих, способных "дать приют" возбудителям. Наоборот, в тех случаях, когда возбудители болезней человека патогенны для переносчиков, отбор должен идти в обратном направлении - к невосприимчивости (при этом, конечно, и к устойчивости к воздействию возбудителя). Все же, термин - это всего лишь имя собственное, раз уж за данным явлением закрепилось название "восприимчивость", я его и употребляю. Прошу лишь помнить, что оно значит. (Если девушку зовут "Марина", это не значит, что ее надо держать в соленой воде.)

В данном случае (как и во всех работах подобного рода) исследования ведутся не с видами в целом, а с определенными популяциями. Соответственно все данные относятся к конкретным популяциям. В тексте, однако, (во избежание бесконечных повторов) это обстоятельство не оговаривается, упоминается только вид. По этой причине фразы типа " Комары An. sacharovi успешно заражаются P. gallinaceum" следует понимать так, что "исследованная популяция An. sacharovi успешно заражается исследованной популяцией (штаммом) P. gallinaceum".

В статистике термин "существенная разница" употребляется как синоним "достоверная разница", в том смысле, что ее возникновение в результате ошибки репрезентативности маловероятно. Поскольку использование терминов-синонимов может привести к путанице, я пользуюсь лишь одним из них: говоря о статистической достоверности разницы, так ее и называю. Термин "существенная" используется в смысле практической значимости, где важно не наличие разницы, а ее величина. Как бы не была велика достоверность разницы, если ее количественное значение не сказывается на интересующих нас процессах или ниже точности наших измерений, для нас она не существенна.

 

2.2. Материалы.

Объектами исследований были кровососущие комары (Culicidae), возбудители малярии (Plasmodium) и инсектицид ДДТ. Выбор указанных объектов вызван следующими причинами: комары имеют в настоящее время самое большое медицинское значение среди всех членистоногих; малярия - самая распространенная трансмиссивная болезнь, от которой погибает наибольшее число людей; ДДТ - инсектицид, который во время проведения исследований был самым распространенным средством борьбы с комарами, особенно малярийными. Кроме того, выбор вызван тем, что данная пара возбудитель-переносчик - удобный объект (плазмодиев можно подсчитать в световом микроскопе, модельные виды безопасны для человека), благодаря чему повышается производительность труда и достоверность результатов.

Часть исследований выполнена на реальных случаях малярии человека, а часть на моделях. Но, результаты, полученные на моделях, также имеют прямое отношение к эпидемиологии этого заболевания. Дело в том, что используемый в модели P. gallinaceum, генетически гораздо ближе к наиболее опасному возбудителю болезни людей - P. falciparum, чем человеческий же P. vivax (Sinden, 1984), а в качестве переносчиков наряду с Ae. aegypti использовались реальные переносчики малярии человека.

Источники материала: ДДТ - из наборов ВОЗ для определения резистентности. P. gallinaceum Brumpt получен из лаборатории экспериментальной химеотерапии ИМПИТМ. Мы поддерживали его, главным образом, перевивкой через Ae. aegypti. P. bergey получен из отдела протозоологии ИМПИТМ. Мы поддерживали его перевивкой через An. stephensi. Штаммы малярии человека получены группой, возглавляемой В.А. Бибиковой (ИМПИТМ), непосредственно от людей, заразившихся в естественных условиях. Поскольку комары были основным объектом изучения, их получению и биологии посвящена специальная глава.

Работа выполнена с использованием 10 видов комаров и 6 видов плазмодиев. В ходе разработки методов культивирования комаров проведено, округленно, 8 000 опытов, в которых использовано 21 600 000 особей (всех стадий развития). Для изучения взаимоотношений комаров и плазмодиев выполнено 972 опытов, в которых просмотрено 1 314 препаратов крови и использовано, округленно, 60 000 комаров, из которых у 32 150 особей была определена зараженность. Объем материала, исследованного в каждом конкретном случае, приведен вместе с результатами.

 

2.3. Методы.

В работе использовано много методов, и стандартных, и оригинальных. По этой причине они описаны в каждом разделе отдельно.  Ниже указаны лишь общие детали.

Уровень паразитемии (концентрации бесполых форм плазмодия в крови позвоночного) определяли по шкале А.И. Немировской (Немировская, 1941; Рабинович, Мошковский, 1964). Уровень гамонтемии (концентрации половых форм плазмодия в крови позвоночного) - путем прямого подсчета паразитов в мазке крови. Данные о зараженности донора приводятся лишь там, где эти показатели в разных вариантах опыта сильно отличались. Если паразитемия не указана, значит она была на уровне 2¸3 баллов. Передача малярии через комаров проверялась паразитологически (по наличию плазмодиев в крови реципиента) и ксенодиагностикой (заражением комаров кровью реципиента).

Всегда (кроме случаев, оговоренных специально) сравниваемые группы комаров выращивали в одних и тех же условиях - в одном сосуде; группы состояли из особей, которые вылупились из яиц в течение одних суток и также (в течение одних суток) вылетели из куколок; они находились на первом репродуктивном цикле (заражающее кровососание было первым). Осемененность самок не учитывали, т.к. специальные опыты и данные независимых исследований (Klowden, 1979), показали, что этот фактор не влияет на кровососание и заражение.

Заражение сравниваемых групп комаров проводили путем кормления на одном доноре, как правило, одновременно. Хотя специальное исследование показало, что и последовательное кормление не влияет на зараженность комаров, к нему прибегали лишь в неизбежных случаях (все они оговорены в тексте).

Везде, где не оговорено иное, и до, и после заражающего кормления сравниваемые группы комаров держали в одном и том же термостате при 27¸28 оС с градиентом влажности от 80 до 100 %; в период спорогонии комары имели возможность пить раствор глюкозы (в градиенте от 5 % концентрации до насыщенного раствора), а также воду. Крови комары больше не получали, так как известно, что плазмодии успешно развиваются и без этого (Расницын, Жарова, 1984). Зараженность определяли у особей, выпивших полную порцию крови. Контроль полноты кровососания осуществляли по характеру растяжения брюшка комаров и отказу от нападения на добычу.

Методика вскрытия комаров и приготовления препаратов была общепринятой (Сергиев, 1934; Collins et all., 1973). Зараженность комаров плазмодиями оценивали, как правило, дважды: на стадии ооцисты (на четвертые или пятые сутки после заражающего кормления) и на стадии спорозоита (на восьмые - десятые сутки после заражающего кормления). Сравниваемые группы комаров исследовались одновременно.

Зараженность комаров оценивалась долей особей (%), имеющих возбудителя, и числом плазмодиев у зараженных особей (экстенсивность и интенсивность заражения). Показатель экстенсивности заражения комаров ооцистами именуется "ооцистный индекс" (сокращенно - ОИ), спорозоитами - "спорозоитный индекс" (СИ). Показатель интенсивности заражения комаров ооцистами именуется "обилие ооцист" (ОО), спорозоитами - "обилие спорозоитов" (ОС). Поскольку метод определения обилия спорозоитов не точен, этот показатель приводится только там, где важна любая информация - в работах с малярией человека.

Кроме общепринятых, использованы также следующие оригинальные методы, оценки выживаемости плазмодиев в комарах:

А) С помощью ооцистно-спорозоитного индекса (ОСИ), который показывает, насколько снизилась доля зараженных комаров на протяжении спорогонии плазмодия.

ОСИ=СИ/ОИ*100 %,

где ОСИ - показатель выживаемости плазмодиев от  ооцисты  до спорозоита;

СИ - доля особей (комаров),  зараженных спорозоитами;

ОИ - доля особей (комаров),  зараженных ооцистами.

Б) По соотношению числа макрогаметоцитов, заглоченных комаром, к числу ооцист, которые в нем образовались.

ВМГ=ОГ/СО*100 %,

где ВМГ - выживаемость макрогаметоцитов;

ОГ - число макрогаметоцитов в порции крови;

СО - среднее число ооцист у всех комаров.

В силу малой точности определения обилия гаметоцитов и вариабельности количества крови, выпитой комарами, этот показатель очень не точен. По этой причине он определялся только в работах с малярией человека.

Поскольку большинство характеристик снимается визуально и, как правило, не поддается проверке, я принял специальные меры: 1) чтобы исключить индивидуальные особенности исследователей, сравниваемые группы анализировал один человек (оператор); 2) чтобы не принять желаемое за действительное, оператор не знал, какая группа анализируется, и при каждой возможности материал из сравниваемых групп шел вперемежку.

Всегда, когда было возможно, опыты планировались так, чтобы получить ответ на несколько вопросов. Это делалось и для экономии времени и материалов, и как способ перекрестной проверки обнаруженных закономерностей. По этой причине при изложении материала неизбежны перекрестные ссылки.

Особенностью данной работы является количественная оценка восприимчивости.  Чтобы это можно было сделать, необходимо знать точность используемых методов. Для выяснения её проведены эксперименты, которые излагаются в специальном разделе.

2.4. Математическая обработка результатов.

Математическая обработка результатов проведена стандартными методами с помощью программ, написанных автором на языках "Бейсик" и "Паскаль". Во всех случаях, где это можно сделать, вместе с результатами приводится доверительный интервал средних значений при р=0.05 (вероятность ошибки репрезентативности 0.05). Исключение представляют данные об обилии ооцист. Для них приведена величина среднего квадратичного отклонения. Это вызвано тем, что распределение зараженных комаров по обилию ооцист не соответствует нормальному.

При анализе статистической достоверности разницы между сравниваемыми группами я ориентировался не на число исследованных особей, а на число повторных опытов. Дело в том, что один опыт (сколько бы ни было в нем особей) характеризует генеральную совокупность составляющих именно этого опыта, а нас интересует генеральная совокупность всех опытов. Подробно этот вопрос разбирается в специальной работе (Расницын и др., 1995).


Гл. 3. ЭНТОМОЛОГИЧЕСКАЯ БАЗА ИССЛЕДОВАНИЙ

Смысл данных, которые мы получаем в результате исследований в любой области науки, зависит от материалов, которые были использованы для их получения. По этой причине, прежде чем переходить к сути разбираемого вопроса, необходимо рассмотреть на какой базе он основывается - каким образом происходит получение энтомологического биоматериала для изучения отношений переносчиков с возбудителями болезней человека.

 

3.1. Принципы культивирования переносчиков.

Результативность работы по созданию и поддержанию культур комаров в значительной мере обеспечена тем, что она была обоснована следующими принципами (Расницын, 1980а, 1986в):

1. Обеспечение безопасности путем использования моделей (видов, не способных распространять болезни людей и важных для человека животных) и экзотических видов, которые не способны жить в той местности, где находится лаборатория (Расницын, 1986в).

2. Создание условий, необходимых и достаточных для жизни и размножения объекта, а не воспроизведение природной обстановки.

3. Предоставление особям градиента условий.

4. Качество биоматериала оценивать не по сходству с природными особями, а по его стабильности и однородности (Расницын, 1986в).

5. Оптимизация культур путем снижения стоимости биоматериала при сохранении его качества и уровня производства (Расницын, 1980а). Повышение плодовитости и выживаемости особей (Тамарина, Максимов, 1989) - лишь одно из средств достижения этой цели.

6. Гуманное отношение к лабораторным животными. Для исследований мы вынуждены использовать животных. Необходимо приносить им как можно меньше страданий. Приведу лишь один пример. Когда я приступил к работе, для того, чтобы комаров накормить кровью, кролика-донора "распинали" на доске и вкладывали в садок. Чтобы избежать этого был сконструирован и изготовлен специальный станок, в котором кролик сидит в нормальной позе, а комарам доступны лишь его уши (рац. предложения ИМПИТМ N 25 и 64). Теперь вместо 2-3 недель кролики живут годами. Выигрыш, кроме того, в том, что процедура кормления стала занимать вдвое меньше времени, увеличилась доля насосавшихся комаров. И, последнее в перечислении, но главное по сути, - перестали мучить животных.

 

3.2. Выбор индикаторов и способ оценки сходства.

Поскольку характеристик, которые могут использоваться для оценки особей, бесконечное количество, приходится выбирать морфофизиологические индикаторы. Теория (Шварц, Смирнов, Добринский, 1968) не содержит методики выбора индикаторов. Специальное исследование (Расницын, 1986а) позволило разработать такой метод. Он основан на оценке степени дисперсии числовой характеристики признака под действием различных факторов. С помощью этого метода обнаружено, что наиболее реактивной характеристикой комаров является плодовитость. По этой причине данный признак и использовался в качестве морфофизиологического индикатора этих насекомых. Вторым по реактивности признаком оказалась масса куколок. Благодаря разработке метода взвешивания куколок комаров (Расницын, Шагов, Демина, 1983), мы смогли использовать и его.

Второй принципиальный вопрос - оценка степени сходства. Почти все современные методы сравнивают объекты без учета генеральной совокупности (Шрейдер, 1971). Единственное исключение - таксономический анализ Е.С. Смирнова (1969). Но этот метод был рассчитан лишь на использование качественных признаков в целях систематики. Специальные преобразования (Расницын, 1965) позволили включить в арсенал этого метода и количественные признаки, а полевые исследования (Расницын, Макарова, Шевелева, 1966) показали, что он пригоден не только в таксономии, но и для любых явлений.

 

3.3. Получение биоматериала.

Энтомологическим материалом исследований служили живые особи. Использование культур клеток, как это делается в вирусологии (Кисленко и др., 1982), не имело смысла - работать с клетками сложнее и результаты дальше от реальности.

Живых особей можно получать и из природных популяций, и из культур. (Под термином "культура" понимаются любые воспроизводящиеся линии животных, содержащиеся в искусственных условиях). Выбор источника зависит от задачи: если надо знать состояние конкретной популяции, единственный источник - данная популяция. Получение материала из нее сводится к отлову. Описано много методов отлова членистоногих, имеющих медицинское значение (сборник "Методы изучения природных очагов болезней человека", 1964; Фасулати, 1971; Расницын, 1974б; Детинова, Расницын, Маркович и др., 1978; Расницын, Косовских, 1979, 1983; Расницын, Бикунова, 1979; Расницын, Лебедева, 1996; Расницын, Лебедева, Давыдов, 1996). Для выбора подходящего разработаны специальные критерии (Расницын, 1978). В остальных случаях пригодны любые особи.

Культура - особая популяция. Она не может быть идентичной ни одной из диких. Культура - модель (Астафьев, Яроцкий, Лебедева, 1989), которую всегда надо сравнивать с реальностью. Различия модели и того, что наблюда­ется в природе, не свидетельство ее недостатков, а возможность познания. Так, например, обнаружение стеногамности An. sacharovi в культуре (Захаро­ва, Расницын, 1985; Расницын, Захарова, Демина, 1984) дало возможность ус­тановить, что эвригамия не является жестким свойством вида, как считалось ранее.

Культура обеспечивает возможность круглогодичных экспериментов, получение биоматериала в большем количестве, в заданный срок и его большую однородность. В ИМПиТМ, например, лишь после того как нами был создан ряда культур и усовершенствованы методы их поддержания, удалось развернуть широкий спектр исследований: оценку инсектицидов, поиск биологических средств борьбы и данную работу - изучение взаимодействия возбудителей и переносчиков.

 

3.4. Создание и поддержание колоний комаров.

Культивирование важно не только тем, что повышает возможность изучения объекта, но и тем, что служит доказательством истинности знаний. Если создана жизнеспособная культура определенных организмов, значит мы сумели воспроизвести условия, необходимые для них.

Культивирование - задача технической энтомологии (Тамарина, 1987, 1990; Злотин, 1989), но создание базы исследований настолько важно, что этим вынужден заниматься почти каждый экспериментатор (и у каждого накапливается свой опыт).

В процессе создания лабораторных колоний комаров выявилась целесообразность отказ от имитации природных условий, а поиск тех, которые необходимы и достаточны для жизни особей. Так, например, обнаружено, что личинки Ae. togoi вовсе не солелюбивы, а солеустойчивы (Ясюкевич, Расницын, 1991); личинки малярийных комаров могут питаться путем обскребывания субстрата (Расницын, Ясюкевич, 1989а; Ясюкевич, Расницын, 1989). На основании этого подхода были созданы культуры 10 видов комаров, 9 из которых использованы в данной работе. Три колонии (Anopheles stephensi List., 1901, Aedes aegypti (L.), 1762 и Ae. togoi Theobald, 1907) были воспроизведены из материала, полученного из школы тропической гигиены (Лондон) и из лаборатории Н.А. Тамариной (МГУ), колонии трех видов (An. atroparvus van Thiel, 1927, An. superpictus Grassi, 1898 и Culex pipiens L, 1758) созданы заново, а трех (An. martinius Schingarev, 1926, An. pulcherrimus Theobald, 1902 и An. sacharovi Favre, 1903) созданы впервые в мире (Расницын, 1985б; Расницын и др., 1989, 1990, 1992). В работе использованы также два "диких штамма" - An. messeae Fall., 1932 из Подмосковья и An. subalpinus из Азербайджана.

С целью оптимизации культур были разработаны специальные алгоритмы, способы, среды и устройства, описанные в статьях (Расницын, 1982а, Шагов и др., 1983; Демина, Шагов, Расницын, 1985; Ясюкевич, Расницын, 1991, 1992), свидетельствах об изобретении (Расницын, Демина, 1979, 1983; Расницын, 1980б; Расницын, Ясюкевич, 1988) и рационализаторских предложениях, список которых приведен в приложении. Для тех видов, которые использовались чаще всего, были составлены инструкции по культивированию.

 

5. Некоторые стороны биологии комаров, имеющие прямое отношение к передаче возбудителей болезней человека.

Изучение комаров позволило выявить ряд аспектов их биологии, имеющих прямое отношение к данной теме. Важнейшие из них:

Таксономическая близость видов не свидетельствует о сходстве всех их свойств. Так по способу питания личинки An. stephensi похожи на личинок Aedes больше, чем на других представителей своего рода - они не фильтруют нейстон, а собирают пищу со дна водоема (Расницын, Ясюкевич, 1989а). Нет прямой связи между таксономической близостью и чувствительностью к инсектицидам (Расницын, Войцик, Ясюкевич, 1991). А это значит, что может не быть такой связи и с восприимчивостью.

Условия развития личинок комаров отражаются на размерах имаго (Расницын, Ясюкевич, 1988), а от этого зависит количество крови, которое они могут высосать (Расницын, Званцов, Ясюкевич, 1991а). Поскольку вероятность попадания возбудителя в организм комара и его количество связаны с количеством принятой крови, можно ожидать зависимости заражаемости от условий развития комаров. Ту же роль может сыграть и общее состояние особей, по крайней мере, на чувствительность к инсектицидам условия развития влияют достаточно сильно (Расницын, Войцик, Евсеева, 1986; Расницын, Войцик, Званцов, 1988; Войцик, Расницын, 1991; Расницын, Войцик, Ясюкевич, 1993; Расницын, Войцик, Скидан, 1993).

Эффект группы зависит и от концентрации особей, и от их численности (Расницын, Волкова, 1982). Оба этих параметра сказываются и на чувствительности к инсектицидам (Алексеев и др., 1983; Расницын, 1985; Расницын, Войцик, Евсеева, 1986), и на активности нападения на добычу (Расницын, 1963). У кровососущих двукрылых существует даже "эффект приглашения" - привлечение особей к добыче теми, кто ее уже нашел (Алексеев, Расницын, Витлин, 1977; Расницын, Алексеев, Витлин, 1978). (Наличие этого эффекта было подтверждено независимыми исследованиями (Ahmadi, McClelland, 1985)). Для переноса инфекций эффект группы имеет значение и в отношении вероят­ности распространения, и при постановке опытов.

Звуковые генераторы, предназначенные для отпугивания комаров, на самом деле их не отгоняют (Расницын и др., 1974). Они лишь имитируют защиту, ослабляя тем самым внимание к переносчикам. Это облегчает комарам нападение на людей и, как результат, распространение возбудителей (Расницын, 1980).


Глава 4. ОЦЕНКА МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ЗАРАЖЕННОСТИ ПЕРЕНОСЧИКОВ.

Чтобы оценить смысл результатов необходимо знать характеристики методов, которыми они были получены.

 

4.1. Оценка наличия возбудителей, их обилия и количества крови, выпитой комаром.

 

Материалы и методы.

Поскольку зараженность определяется визуально, результаты зависят от свойств операторов. По этой причине опыты проведены с теми людьми, которые участвовали в основных исследованиях. Чтобы избежать искажений ни один из них, кроме меня (СР), не подозревал об этих опытах.

В опытах использованы P. gallinaceum, Ae. aegypti и An. sacharovi. Методы оценивали путем сравнения повторных оценок одних и тех же препаратов одним и тем же оператором. Чтобы избежать запоминания, повторный анализ проводился в ином (случайном) порядке; мазки крови просматривались повторно не ранее, чем через месяц, а препараты комаров в тот же день, партиями не менее 25 штук.

Количество заглоченной крови определяли по разнице веса группы из 10 особей до и после кормления. Метод оценивался сравнением результатов взвешивания разными людьми с интервалом, не более 5 минут.

 

Результаты. 

4.1.1. Определение наличия и обилия возбудителя в крови донора.

Несовпадения в обнаружении плазмодиев (табл. 1) редки: на 240 оценок только 3 несовпадающих (2 %). Обилие бесполых форм плазмодиев в среднем определяется с точностью +1 балл, половых еще менее точно (табл. 2).

 

Таблица 1. Анализ результатов повторного определения наличия плазмодиев в крови позвоночного.

 

Показатель

Оператор

 

 

НД

РАЖ

СР

МБ

Число просмотренных препаратов

Максимальное число препаратов, в которых обнаружен плазмодий

Доля (%) случаев совпадения повторной оценки наличия плазмодиев

Доля (%) случаев совпадения повторной оценки наличия  макрогаметоцитов в препаратах с плазмодиями

30

 

19

 

100

 

100

10

 

8

 

90

 

86

80

 

66

 

98

 

98

20

 

18

 

100

 

100

 

 

Таблица 2. Анализ результатов повторного определения обилия плазмодиев в крови позвоночного.

Показатель

Оператор

 

НД

РАЖ

МБ

Число просмотренных препаратов

8

19

18

Среднее отклонение оценки паразитемии (баллы)

1,0

0,7

0,8

Доля (%) случаев совпадения повторной оценки уровня паразитемии

12

16

17

Доля (%) случаев разницы в повторной оценке уровня паразитемии на 0.5 балла

12

16

29

Доля (%) случаев разницы в повторной оценке уровня паразитемии на 1 балл

50

47

44

Доля (%) случаев разницы в повторной оценке уровня паразитемии на 1.5 балла

12

25

0

Доля (%) случаев разницы в повторной оценке уровня паразитемии на 2 балла

12

0

0

Доля (%) случаев разницы в повторной оценке обилия гамонтов не более, чем в 1.5 раза

14

16

35

Доля (%) случаев разницы в повторной оценке обилия гамонтов более чем в 1.5, но менее чем в 2 раза

42

43

23

Доля  (%) случаев разницы в повторной оценке обилия гамонтов в 2 - 3 раза

14

32

23

Доля (%) случаев разницы в повторной оценке обилия гамонтов более, чем в 3 раза    

29

11

18

 

4.1.2. Определение зараженности переносчика.

Наличие возбудителя определяется почти безошибочно: всего 2 расхождения повторных оценок - 1 из 401 препарата средней кишки (0.25 %) и 1 из 283 препаратов слюнных желез (0.35 %).

Подсчет ооцист (табл. 3) при малом их числе точен: расхождения повторных оценок редки (1 на 30 препаратов) и величина их ничтожна (в среднем 1 %). Чем больше ооцист, тем чаще расхождения, и когда ооцист более 100 - постоянны. Но величина их мала (в среднем 10 %). Разброс ошибок соответствует нормальному распределению.

 

Таблица 3. Анализ результатов повторного подсчета ооцист у одних и тех же особей комаров

Показатель

Класс по обилию

1¸10

11¸50

51¸100

101¸200

>200

Число просмотренных особей

30

83

94

43

34

Среднее обилие ооцист при первом просмотре     

6.0   

30.0    

74.9

155.6

253.9

Среднее обилие ооцист при втором просмотре     

6.1   

30.0    

75.5

153.9

252.5

Число несовпадений результатов двух просмотров

1

32

87

43

34

Доля (%) несовпадений результатов двух просмотров

3

39

93

100

100

Максимальная разница несовпадений результатов (%)

10

10

7

16

17

Средняя разница несовпадений результатов (%)

1

2

4

7

9

 

4.1.3. Количество крови, выпитой переносчиком.

Результаты повторных взвешиваний (табл. 4) показывают, что отклонения данных обычно менее 1 % (в среднем 0.8 % для голодных и 0.6 % для накормленных кровью особей).

 

Таблица 4. Результаты повторного взвешивания комаров.

N опыта

Голодные особи

Особи с кровью

Вес крови

I

II

d

I

II

d

max

min

d

1

2

24.1

26.9

24.1

26.9

0.0

0.0

58.0

71.6

58.2

72.2

0.3

0.8

34.1

45.3

33.9

44.7

0.6

1.3

3

4

19.6

16.6

19.7

16.7

0.5

0.6

65.3

51.5

65.5

51.7

0.3

0.4

45.9

35.1

45.6

34.8

1.7

0.9

5

6

25.0

27.1

24.8

27.3

0.8

0.7

71.2

72.1

70.8

72.0

0.6

0.1

46.4

45.0

45.8

44.7

1.3

0.7

7

8

24.1

26.4

23.5

26.3

2.5

0.4

65.6

69.4

66.1

68.9

0.8

0.7

42.6

43.1

41.5

42.5

2.6

1.4

9

10

19.3

18.7

19.3

19.1

0.5

2.1

53.5

45.5

53.9

45.9

0.7

0.9

34.6

27.2

34.2

26.4

1.2

3.0

Обозначения: I - первый результат взвешивания группы из 10 особей (мг); II - второй результат взвешивания группы из 10 особей (мг); d - относительная (в %) разница показателей к их среднему значению; max - максимальный результат определения количества выпитой крови (мг); min - минимальный результат определения количества выпитой крови (мг).

 

4.2. Влияние способа кормления переносчиков кровью на их зараженность возбудителями.

Хотя искусственное кормление насекомых кровью применяется широко (Gordon, 1922; Yoeli, 1938; Bishop, Gilchrist, 1944, 1946; Gierberg, Kutz, 1971; Супряга, Дашкова, Расницын, 1978; Yano, Kozlowska, Maramorosch, 1990) и описано много устройств для этой работы (Карибов, 1928; Collins, Harrison, Skinner, 1964; Ponnudurai et all., 1989), до сих пор не было известно, как искусственные методы влияют на заражение комаров плазмодиями. Цель настоящей работы (Дашкова, Расницын, 1978) - восполнить указанный пробел.

 

Материалы и  методы.

Схема опыта: Каждую партию комаров An. atroparvus делили на две группы: группу "Е" кормили на человеке, а группу "И" - искусственно кровью того же донора, взятой из локтевой вены непосредственно перед кормлением на нем комаров группы "Е" или сразу после него в аппарате Rutlage et all. (1964). Эту кровь смешивали с консервантом (3.8 % цитрата натрия или ЦОЛИПК 7 Б) в соотношении 4:1. Между естественным и искусственным кормлением комаров проходило 1.5 - 2 ч. Длительность кормления на человеке и через мембрану была одинаковой. В крови, взятой из пальцев больных во время кормления комаров, а также подготовленной для искусственного кормления, подсчитывали число гаметоцитов на 500 лейкоцитов.

 

Результаты и обсуждение

 

4.2.1. Накармливаемость комаров.

Опыты (табл. 5) не выявили влияния способа кормления на активность кровососания комаров: в итоге на человеке насосалось крови 57 % подсаженных комаров, а на кормушке 59 %.

 

Таблица 5.  Пищевая активность комаров An.  atroparvus при разных способах дачи им крови.

 

N опыта

Способ кормления кровью

естественный

искусственный

n

D

n

D

1

100

89    81¸94

150

43    36¸51

2

100

48    39¸58

120

75    67¸82

3

100

55    45¸64

100

55    45¸64

4

100

55    45¸64

100

74    65¸82

5

90

80    71¸87

70

51    40¸63

6

100

42    33¸52

100

50    40¸60

7

50

38    26¸52

50

64    50¸76

8

80

50    39¸61

80

65    54¸74

9

80

54    43¸64

100

56    46¸65

Все

800

57    53¸60

870

59    56¸62

Обозначения: n - число подсаженных особей, D - доля (%) особей с кровью после определенной экспозиции и доверительный интервал этого показателя при р=0.05.

 

4.2.2. Обилие гаметоцитов.

Поскольку при естественном кормлении комары пили кровь из периферической системы, а на кормушке - венозную, встал вопрос о распределении плазмодиев. Оказалось (табл. 6), что обилие гамето­цитов в периферической крови почти в точности равно их числу в венозной крови. (Разница в 10 % значительно ниже точности метода.)

 

Таблица 6. Распределение половых форм Pl. vivax в крови человека. (Число гаметоцитов на 500 лейкоцитов.)

N

опыта|

Порядковый N -

приступа малярии

Микрогаметоциты

ПК    |    ВК

Макрогаметоциты

ПК     |    ВК|

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Все

6

8

5

6

6

4

6

5

5

1            2

2            5

32           37

 11            11

9               13

 14             15

8           10

11          17

35          35

14           16

3            5

8             9

 53          59

 17          19

 12           13

 18            19

 14           15

 19            21

54              50

22             23

Обозначения: ПК - в периферической крови, ВК - в венозной крови.

 

4.2.3. Сохранение возбудителя в консервированной крови. В крови с консервантом гаметоциты обнаруживались значительно дольше того срока, который проходил между взятием крови и кормлением ею комаров (табл. 7). Но основным доказательством сохранения возбудителя является факт заражения комаров.

 

Таблица 7. Выживание половых форм Pl. vivax в процессе хранения консер­вированной крови.  (Число гаметоцитов на 500 лейкоцитов в крови с консерван­том в разные сроки хранения.)

Срок хранения

крови, часы

Микрогаметоциты

Макрогаметоциты

Опыт 1

Опыт 2

Опыт 1

Опыт 2

0.5

9

-

16

-

1.0

11

14

20

24

1.5

12

15

16

27

2.0

4

14

8

19

2.5

13

10

15

21

3.0

7

11

13

14

3.5

10

14

12

18

4.0

9

10

13

21

4.5

8

9

14

17

M

9.2

12.1

14.1

20.1

s

2,7

2.4

3.3

4.1

KV %

29.6

19.4

23.4

20.3

Обозначения: М - среднее значение; s - среднее квадратичное отклонение; KV - коэффициент вариации.

 

4.2.4. Зараженность комаров при разных способах кормления их кровью. При искусственном кормлении экстенсивность заражения комаров (табл. 8 и 9) была несколько ниже, чем при естественном (32 % против 48 % по ооцистам и 20 % против 24 % по спорозоитам). Интенсивность заражения также была ниже (7.8 ооцисты против 9.2 ооцист). Разница эта статистически достоверна (р<0.01). Ее причина - разбавление крови консервантом.

 

Таблица 8. Зараженность комаров An. atroparvus возбудителем малярии Pl. vivax на стадии ооцисты при разных способах кормления кровью.

N

опыта

Естественное кормление

Искусственное кормление

n

ОИ

ОО

n

ОИ

ОО

1

32

22    11¸39

1.6

16

19    7¸43

2.0

2

20

30    14¸52

2.0

31

23    11¸40

3.0

3

10

60    31¸83

9.8

39

33    21¸49

19.5

4

12

33    14¸61

2.5

16

38    18¸61

2.0

5

10

60    31¸83

18.3

14

43    21¸67

6.0

6

14

29    12¸55

1.8

14

29    12¸54

1.5

7

4

50    15¸85

1.0

8

38    14¸69

2.3

8

9

44    19¸73

48.0

12

50    25¸75

10.1

9

13

38    18¸64

1.2

14

29    12¸55

1.2

Все

91

48    38¸58

9.2

164

32    25¸39

7.8

Обозначения: n - число исследованных комаров, ОИ - ооцистный индекс и доверительный интервал этого показателя при р=0.05; ОО - обилие ооцист.

 

Таблица 9. Зараженность комаров An. atroparvus возбудителем малярии Pl. vivax на стадии спорозоита при разных способах кормления кровью.

N

опыта

Естественное кормление

Искусственное кормление

n

 СИ

n

СИ

1

32

16        7¸32

18

11      3¸33

2

15

27       11¸52

47

15     7¸28

3

23

35      19¸55

33

27    15¸44

4

21

24     11¸45

40

15     7¸29

5

28

18      8¸36

18

28    12¸51

6

13

23      8¸50

25

20     9¸39

7

10

30     11¸60

20

15    15¸36

8

7

29      8¸64

25

24    12¸43

9

20

30     15¸52

30

23    12¸41

Все

169

24       18¸31

256

20    15¸25

Обозначения: n - число исследованных комаров, СИ - спорозоитный индекс и доверительный интервал этого показателя при р=0.05.

 

Во всех опытах наблюдалось снижение доли зараженных особей на протяжении спорогонии. Разница между ооцистным и спорозоитными индексами велика (в среднем в два раза) и статистически достоверна (P<0.01). Такое снижение говорит о неполном выживании плазмодиев в комаре: часть ооцист дегенерирует, не все спорозоиты достигают слюнных желез (Collins et al., 1976). Влияние способа кормления кровью на выживаемость плазмодиев не проявилось (табл. 10).

 

Таблица 10.  Выживаемость возбудителей малярии Pl.  vivax в комарах An. atroparvus в течение спорогонии (%).

Способ кормления

N опыта

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Все

Естественный

73

90

58

73

30

79

60

66

79

68

Искусственный

58

65

82

39

65

69

39

48

79

60

 

Заключение.

Опыты показали приемлемость искусственного кормления кровью для заражения комаров возбудителями малярии.

 

4.3. Влияние порядка кормления переносчиков на доноре на их зараженность возбудителями.

Чтобы соблюсти идентичность условий заражения сравниваемых групп переносчиков, мы кормили их кровью донора одновременно. Но это не всегда возможно: если сравниваемых групп много, приходится кормить их последовательно. Нельзя исключить, что это отразится на зараженности. Данная работа выполнена для проверки указанного предположения.

 

Материалы и методы.

В работе использованы Ae. aegypti и An. sacharovi, P. gallinaceum и цыплята. Опыты состояли в том, что на одном и том же доноре последовательно кормили 16 групп комаров (в каждой группе было около от 100 до 120 са­мок). При этом одновременно кормили по две группы. Для анализа на зараженность из каждой группы брали выборку.

Результаты и обсуждение.

Порядок кормления не повлиял на зараженность комаров: нет зависимости ни одного из показателей зараженности ни у одного из видов комаров от по­рядка их кормления (рис. 1, 2). Это подтверждает и количественный анализ - коэффициенты корреляции между порядком кормления и показателями заражен­ности невелики и статистически недостоверны (табл. 11).

 

Рис. 1. Экстенсивность заражения групп комаров, накорм­ленных последовательно на одном и том же доноре с гаметоцитами P. gallinaceum в крови.

По оси абсцисс - порядковый номер кормления группы.

По оси ординат - доля заразившихся комаров (в %).

А - Ae. aegypti.

Б - An. sacharovi.

 

Рис. 2. Интенсивность заражения групп комаров, накорм­ленных последовательно на одном и том же доноре с гаметоцита­ми P. gallinaceum в крови.

По оси абсцисс - порядковый номер кормления группы.

По оси ординат - среднее число ооцист у заразившихся ко­маров.

А - Ae. aegypti.

Б - An. sacharovi.

 

Таблица 11. Статистическая связь между порядком кормления и показателя­ми зараженности семей комаров.

Коэффициент корреляции между

порядком кормления и

Вид

Ae. aegypti

An. sacharovi

интенсивностью заражения

0.19 ± 0.26 

  0.18 ± 0.26

экстенсивностью заражения

0.13 ± 0.26  

 0.05 ± 0.27

 

Такой результат имеет два следствия. 1) позволяет считать идентичными последовательные заражающие кормления комаров на цыплятах, если комаров менее полутора тысяч; 2) свидетельствует о том, что инфективные гаметоциты P. gallinaceum не скапливаются в капиллярах кожи. В нашем случае каждый раз было накормлено не менее полутора тысяч комаров, которые изъяли много периферической крови (около 4 мл Ae. aegypti и около 5.5 мл An. sacharovi, что весьма существенно для 7-10 дневного цыпленка), а зараженность не снизилась. Значит, приток крови из внутренних сосудов приносил жизнеспособные гаметоциты в концентрации, не уступающей капиллярной крови. Этот вывод совпадает с изложенными выше данными о P. vivax.

 

Выводы.

1. Инфективные гаметоциты P. gallinaceum не скапливаются в капиллярах кожи.

2. Последовательное кормление до полутора тысяч комаров на одном цып­ленке не влияет на их зараженность.

 

4.4. Влияние обилия возбудителей на зараженность переносчиков.

На вопрос о связи зараженности комаров с обилием плазмодиев есть три точки зрения: одни авторы (Boyd, 1940; Lumsden, Bertram, 1940; Сергиев, Тибурская, 1944; Macdonald, 1952) сталкивались со случаями, когда эта связь была тесна и однозначна, другие (Ременникова, 1946; Eyles, 1951) не видели четкой зависимости, а по мнению А.Н. Алексеева (1985) существует оптимальная заражающая доза, наличие которой - критерий специфического характера отношений между возбудителем и переносчиком (Алексеев, 1984). Поскольку выводы разных авторов не совпадают, а этот фактор невозможно стабилизировать, пришлось этим вопросом заняться специально.

 

Материалы и методы.

Зависимость заражения комаров от концентрации возбудителя в крови донора определялась двумя способами. Первый: брали кровь цыпленка с предельно высоким уровнем гамонтемии; путем добавления незараженной крови приготовляли несколько вариантов концентрации, которыми в дальнейшем кормили комаров. Второй: по мере протекания болезни у позвоночного хозяина на нем накармливали группы комаров, выращенных в одинаковых условиях.

 

Результаты и обсуждение.

Связь между обилием возбудителя и заражением переносчика конечно есть. Нижний предел неизбежен - если возбудителя в крови донора нет, переносчик не заразится. В отношении малярии можно утверждать, что нижний предел концентрации гаметоцитов не высок. Так заражение комаров наблюдалось при наличии 8 микро- и 4 макрогаметоцитов на 1 мкл. крови (James, 1931), т. е. около 30 микро- и 15 макрогаметоцитов на среднюю порцию крови, выпиваемую одним комаром. В некоторых случаях (Moore et al., 1945; Young et al., 1946) отмечалось, что заражение комаров прекращается, когда концентрация гаметоцитов ниже 5 на 1 мкл. Заражение комаров наблюдали и при более низком обилии возбудителя (Young et al., 1945, 1946), даже тогда, когда плазмодиев в крови донора обнаружить не удается (Young, Burgess, 1948). Наблюдались и обратные случаи: отсутствие заражения комаров при микроскопически значимом обилии паразитов (Лысенко, Левитанская, 1951). Впрочем, одно не противоречит другому - в последнем случае половые формы плазмодиев могли отсутствовать.

Результаты наших опытов (табл. 12) подтверждают, что комары могут заразиться при низком обилии возбудителей. Поскольку эти опыты не имели целью поиск минимальной дозы, вероятно, она гораздо ниже приведенных значений. Ценность этих данных в том, что они служат отправной точкой для дальнейших исследований.

 

Таблица 12.  Минимальная концентрация гаметоцитов, при которой обнаружено заражение комаров плазмодиями малярии.

 

Возбудитель

 

Переносчик

Гаметоциты

Макро         |          Микро

МКЛ  | СПК     |      МКЛ | СПК

Pl. bergey

Pl. gallinaceum

Pl. gallinaceum

Pl. gallinaceum

Pl. gallinaceum

Pl. vivax

Pl. vivax

Pl. vivax

An. stephensi

Ae. aegypti

Ae. togoi

An. pulcherrimus

An. sacharovi

An. atroparvus

An. messeae

An. sacharovi

17          44                 11           28

12          36                12         36

5           23                   7             32

22         52                 19           48

14         56                 10           40

32       100                17          76

185      100               132          76

185      100               132           76

Обозначение: МКЛ - число гаметоцитов на 1 мкл крови; СПК - число гаме­тоцитов в средней порции крови, выпиваемой одним комаром.

 

Необходимо учесть, что нижний предел концентрации возбудителя различен для разных видов возбудителей и переносчиков. Свидетельство тому - отсутствие корреляции в показателях зараженности при разном сочетании взаимодействующих организмов. (Этот вопрос разбирается ниже.)

Поскольку нижний предел концентрации возбудителя, достаточный для заражения переносчика, в каждом конкретном случае может быть своеобразным, а определять его очень трудно, для страховки, целесообразно считать его равным единице (1 макро- и 1 микрогаметоцит).

Верхний предел концентрации возбудителя неизбежен. Возможны три варианта: 1) избыток возбудителей убивает переносчика; 2) избыток возбудителей ведет к снижению зараженности; 3) число возбудителей, которые могут выжить в переносчике, не превышает определенной величины. В первых двух вариантах должна быть оптимальная доза, в третьем - нет. Для плазмодиев возможность предела емкости видна воочию - ооцист бывает столько, что они сидят бок о бок (фото 1).

 

Фото 1. Ооцисты Pl. gallinaceum на средней кишке An. sacharovi.

 

О максимальной заражающей дозе можно судить по числу ооцист в одном комаре (число макрогаметоцитов не могло быть меньше). Наши факты сведены в таблицу 13. Нельзя утверждать, что они соответствуют верхнему пределу заражения, но можно не сомневаться, что он не ниже указанного. Приведенные цифры не самые высокие: при заражении An. atroparvus мадагаскарским штаммом P. vivax у некоторых особей образовывалось более 1000 ооцист (Shute, Maryon, 1954), а в опытах В.Н. Ременниковой P. vivax тогда, когда в крови больного было более 1200 гаметоцитов (каких не указано) на 1 мкл (около 5000 на порцию крови).

 

Таблица 13. Максимальное число ооцист, обнаруженных у одного комара.

Возбудитель  |

Переносчик

МЧО

Pl. bergey

Pl. gallinaceum

Pl. gallinaceum

Pl. gallinaceum

Pl. gallinaceum

Pl. vivax

Pl. vivax

Pl. vivax

An. stephensi

Ae. aegypti

Ae. togoi

An. pulcherrimus

An. sacharovi

An. atroparvus

An. messeae

An. sacharovi

42

174

2000

590

570

16

17

17

Обозначение: МЧО - максимальное число ооцист, обнаруженных у одного комара.

 

Несмотря на большое число опытов, в которых часто использовались доноры с предельно высокой концентрацией гаметоцитов, мы ни разу не столкнулись со случаем, когда снижение зараженности комаров можно было бы связать с высокой паразитемией донора. И в литературе, кроме работы А.Н. Алексеева (1985), ни один такой случай не отмечен.

 

Верхний предел концентрации плазмодиев для комаров не связан с их гибелью. Об этом свидетельствуют отсутствие разницы в зараженности погибших и живых особей (табл. 14) и в гибели комаров, накормленных на донорах с разным уровнем паразитемии, поскольку она всегда мала (табл. 15).

 

Таблица 14. Сравнение интенсивности заражения живых и мертвых комаров, из одной группы, кормившихся одновременно кровью одного донора.

 

Возбудитель|

 

 

Переносчик

 

 

Ж/М

 

n

Показатели зараженности

ОИ   |   ОО   |   МЗ

 

Pl. gallinaceum

Pl. gallinaceum

Ae. aegypti

Ae. aegypti

Ж

М

475

32

80       21       145

84       16        44

 

Pl. gallinaceum

Pl. gallinaceum

Ae. togoi

Ae. togoi

Ж

М

357

32

86      123     2000

88       97       990

 

Pl. gallinaceum

Pl. gallinaceum

An. pulcherrimus

An. pulcherrimus

Ж

М

308

32

75       111      590

53        76        353

 

Pl. gallinaceum

Pl. gallinaceum

An. sacharovi

An. sacharovi

Ж

М

529

32

54        83         570

47        67        420

 

Pl. vivax

Pl. vivax

An. atroparvus

An. atroparvus

Ж

М

203

20

24         7          16

25         7          12

 

Pl. vivax

Pl. vivax

An. messeae

An. messeae

Ж

М

62

7

34          6          17

29          4           6

 

Pl. vivax

Pl. vivax

An. sacharovi

An. sacharovi

Ж

М

42

4

29           7          17

25          11          11

Обозначения: N - условный номер опыта; Ж/М - показатель состояния: Ж - живые, М - мертвые; n - число исследованных особей; ОИ - ооцистный индекс; ОО - обилие ооцист; МЗ - максимальное число ооцист у одного комара.

 

Таблица 15. Средняя гибель комаров в период от заражения до вскрытия на ооцисты.

Возбудитель

Переносчик

Гибель(%)

Pl. bergey

Pl. gallinaceum

Pl. gallinaceum

Pl. gallinaceum

Pl. gallinaceum

Pl. vivax

Pl. vivax

Pl. vivax

An. stephensi

Ae. aegypti

Ae. togoi

An. pulcherrimus

An. sacharovi

An. atroparvus

An. messeae

An. sacharovi

43

7

15

23

16

21

18

17

 

Какова зависимость заражения переносчика от обилия возбудителя внутри указанных границ при прочих равных сказать трудно, т. к. прочие не бывают равными. Причина в том, что в естественных условиях изменение паразитемии сопровождается изменением уровня иммунитета, влияющего на инфективность плазмодиев для комаров (Carter, Chen, 1976; Dwadz, 1976; Mendis, 1978; Nussenzweig, 1982; Ranawaka, 1988; David et all., 1990).

Имеющиеся же данные таковы. При кормлении комаров на одном доноре в течение его болезни в случае P. bergey и An. Stephensi, наблюдались 3 варианта: при молниеносном течении болезни (рис. 3а) зараженность переносчика росла параллельно росту гамонтемии: при среднесрочном течении болезни, с середины ее, несмотря на рост гамонтемии, зараженность комаров стабилизировалась (рис. 3б), а при затяжном течении, к концу болезни зараженность их снижалась и даже прекращалась (рис. 3в). Но эти изменения зараженности не связаны с обилием возбудителя напрямую. В случае затяжной болезни зараженность комаров стабилизируется, снижается и даже прекращается при низком уровне гамонтемии, а случае молниеносного течения она растет при высоком обилии гамонтов. Это значит, что дело не в количестве плазмодий, а в накоплении антител, угнетающих половые формы паразита.

 

Рис. 3. Изменение во времени концентрации гаметоцитов Pl. bergey в крови белой мыши и доли (в %) заражающихся An. stephensi. (Схема.)

По оси абсцисс - дни с самого раннего появления га­метоцитов.

По оси ординат - Доля (в %) зараженных комаров и относительная концентрация гаметоцитов.

Обозначения: 1 - относительная концентрация гаметоцитов; 2 - доля зараженных комаров.

А - при молниеносном течении болезни.

Б - при среднесрочном течении болезни.

В - при затяжном заболевании.

 

Отсутствие оптимальной заражающей дозы демонстрирует и материал других исследователей (Ременникова, 1946; Eylis, 1951). На графике гамонтемия - зараженность имеются пики, но их несколько. По данным E. Eylis (1951), например, их восемь, и самый высокий при максимальном обилии гаметоцитов.

И при изменении концентрации гаметоцитов разбавлением крови, поиск оптимальной заражающей дозы не дал результата. Судя по первому опыту (табл. 16) можно думать, что искомая доза найдена: когда гаметоциты заселяли 0.75 % эритроцитов доля зараженных комаров были наивысшей. Но в сл­дующем опыте (табл. 17) при такой же концентрации возбудителя (1 %) оба показатели заражения были не самыми высокими. К тому же, статистический анализ показывает, что пик заражаемости в первом опыте могли быть вызваны ошибкой репрезентативности.

 

Таблица 16. Влияние разведения крови донора на зараженность комаров Ae. aegypti возбудителем малярии Pl. gallinaceum. (Доля эритроцитов, содер­жащих гаметоциты, в исходной крови 3 %).

Концентрация

крови

Доля эритроцитов с

гаметоцитами (%)|

n

ОИ

ОО

100 %

3

14

43   21¸67

17

50 %

1.5

35

31   19¸48

24

25 %

0.75

35

69   52¸81

35

12 %

0.375

35

46   30¸62

22

Обозначения: n - число исследованных особей; ОИ - ооцистный индекс и доверительный интервал этого показателя; ОО - обилие ооцист.

 

Таблица 17. Влияние разведения крови донора на зараженность комаров Ae. aegypti возбудителем малярии Pl. gallinaceum. (Доля эритроцитов, содер­жащих гаметоциты, в исходной крови 11 %).

Концентрация

крови

Доля эритроцитов с

гаметоцитами (%)|

n

ОИ

ОО

100 %

11

21

38   21¸59

22

10 %

1

23

35   19¸55

18

1 %

0.1

35

20   10¸36

7

0.1 %

0.01

34

0     0¸8

0

Обозначения: n - число исследованных особей; ОИ - ооцистный индекс и доверительный интервал этого показателя; ОО - обилие ооцист.

 

Таким образом, каким бы способом концентрация гаметоцитов не изменялась, соответствующего изменения зараженности комаров не происходит. Отсюда следует, что концентрация гаметоцитов в крови донора внутри пороговых ее значений не является ведущим и, тем более, единственным фактором крови, определяющим заражение комаров. Позднее мнение об отсутствии четкой зависимости зараженности комаров от количества заглоченных гаметоцитов было подтверждено (Rosenberg, Koonz, 1984; Ponnudurai et all., 1989; Puri et all., 1989; Kitthawee et all., 1990).

Интересно сопоставить данные по малярии с другими возбудителями. Для заражения триатомового клопа достаточно попадания в него одной трипаносомы (Moll-Merks, Werner, Donges, 1988). Зараженность An. gambiae и An. arabiensis микрофиляриями Wuchireria bancrofti прямо пропорциональна уровню паразитемии, а заражение An. melas очень слабо коррелировало с этим показателем (Bryan, Southgate, 1988). Наблюдали и наличие оптимальной заражающей дозы (Kasai, Williams, 1986), но это в случае филярий, которые патогенны для переносчика. Все эти данные говорят о своеобразии процессов, происходящих в каждом конкретном случае, о необходимости индивидуального подхода.

Выводы.

1. Минимальная заражающая доза гаметоцитов различна для разных сочетаний плазмодиев и комаров, но во всех случаях она низка; для страховки ее надо считать равной единице (1 микро и 1 макрогаметоцит).

2. Существует верхний предел числа ооцист, которые могут образоваться в комаре.  Для разных сочетаний организмов этот предел различен и достигается при разной дозе гаметоцитов.

3. Избыточное количество плазмодиев не вызывает гибели комаров и снижения их зараженности.  Нет оптимальной заражающей дозы плазмодиев малярии для комаров.

4. Концентрация плазмодиев малярии в крови донора не является ведущим и, тем более, единственным фактором крови, определяющим заражение комаров.


Глава 5. СВЯЗЬ ВОСПРИИМЧИВОСТИ С ТАКСОНОМИЧЕСКИМ ПОЛОЖЕНИЕМ И ГЕОГРАФИЧЕСКИМ ПРОИСХОЖДЕНИЕМ ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ ОРГАНИЗМОВ.

 

Первая задача медицинской энтомологии в аспекте трансмиссивных болезней - выявление переносчиков: "кто может заразить человека определенной болезнью?", и, обратно, "чем может заразить человека определенное членистоногое?". Другими словами: "какие группы членистоногих и микроорганизмов способны образовывать эффективные ксено-пары?" или, короче, "в каких случаях существует восприимчивость?".

Благодаря исследованиям В.Н. Беклемишева (1948, 1955), А.Н. Алексеева (1984а, 1984б, 1985а) и ряда других к началу наших работ ответ на этот вопрос имелся. Но не точнее, чем на уровне семейства. Хотя факты различной восприимчивости разных видов были известны, им, считалось, не следует придавать большого значения (Беклемишев, 1941). Возникновение специфического переноса считалось продуктом длительной эволюции (Беклемишев, 1955). Все же, поскольку практика имеет дело с видами и популяциями, вставал вопрос о различиях в восприимчивости и на этом уровне. Попытки ответить на него путем регистрации случаев переноса (Детинова, Смелова, 1973; Sollers-Riedel, 1978) не решает вопроса. Дело в том, что эти списки оперируют видами, а на практике мы имеем дело с популяциями, различия между которыми нельзя исключить. Кроме того, отсутствие зарегистрированных случаев переноса не гарантирует отсутствия восприимчивости. И, наконец, нет гарантии, что уровень восприимчивости или даже ее наличие не изменятся во времени.

До начала наших работ сведения о восприимчивости комаров к экзотическим штаммам плазмодиев были невелики и не однозначны. В некоторых случаях наблюдалось отсутствие восприимчивости (James, 1931; Shute, 1940; Shute, Maryon, 1947;Jeffery at al., 1954), а в других - ее наличие (Тибурская, 1962, 1965). Такое положение требовало продолжения исследований в данной области В. А. Бибикова (1977). Этому и посвящена данная работа (Бибикова и др., 1978).

Мы хотели узнать, как влияет на эффективность переноса географическая изоляция взаимодействующих организмов. Изучение восприимчивости Anopheles к экзотическим видам и штаммам малярийных паразитов, выполненное в связи с их завозом в США и Европу, дало не однозначные результаты. В одних случаях комары заражались, в других - нет. Так было установлено, что An. atroparvus, который был эффективным переносчиком европейских штаммов P. falciparum, совершенно невосприимчив к штаммам того же вида из Малайи, Индии и некоторых стран Африки (James, 1931; Shute, 1940; Shute, Maryon, 1947), а An. albimanus, переносчик малярии в Южной и Центральной Америке, невосприимчив к P. vivax из Новой Гвинеи (Jeffery at al., 1954). Никакой законо­мерности выявлено не было.

Данные о восприимчивости комаров фауны СССР к экзотическим штаммам малярии еще более скудны. Имеются лишь две работы, показавшие возможность заражения An. atroparvus одним корейским и двумя вьетнамскими штаммам трехдневной малярии (Тибурская, 1962, 1965). Переносить на условия нашей страны данные зарубежной литературы (полученные в других условиях на другом биоматериале), как справедливо отмечает В. А. Бибикова (1975), без проверки нельзя.

 

Материалы и методы

В работе использован P. vivax, выделенный от больного, заразившегося в Бразилии, и комары An. atroparvus. Использованная линия An. atroparvus происходит из окрестностей Краснодара, а, вообще, данный вид комаров встречается лишь в европейском Средиземноморье и прилегающих к нему районах (Беклемишев, 1944; Беклемишев, Желоховцев, 1945), т. е. далеко от Южной Америки. В качестве переносчика местной малярии он играл большую роль в Испании и в Приазовье (Беклемишев, 1944).

Заражали людей, нуждающихся в маляриотерапии. В мазках крови, взятых в момент кормления комаров, подсчитывали число макро и микрогаметоцитов на 200 лейкоцитов.

Комаров брали ни разу не пивших кровь. Их держали до и после заражения при температуре 23-25о и влажности 80-95%. В отличие от остальных наших исследований, в данном случае вскрытие на ооцисты и спорозоиты проведено не в стандартные сроки (фактические данные приведены вместе с результатами), и число ооцист подсчитывали не точно, а по шкале А. Я. Лысенко и П. Б. Левитанской (1952): от 1 до 10 ооцист на желудке - 1 балл; от 11 до 25 - 2 балла; от 26 до 100 - 3 балла; свыше 100 - 4 балла.

В таблице 18 представлен материал, использованный в данном исследова­нии.

 

Таблица 18. Материал исследования.

N

опыта

Источник

заражения

комаров

Порядковый номер при­ступа

Число гаметоцитов

на 200 лейкоцитов

Микро | Макро

Число комаров,

накормленных

кровью

1

2

3

4

5

6

7

8

Больной Т.

Он же

Он же

Больной Б.

Больная Р.

Она же

Больная Н.

Она же

7

9

10

7

9

7

5

7

3           9

5          19

6          21

3           11

1            1

1            3

5          16

7            22

13

41

24

30

58

12

15

16

 

Результаты и обсуждение

Заражение An. atroparvus бразильским штаммом P. vivax обнаружено во всех опытах (табл. 19). Чем выше была концентрация гаметоцитов в крови, тем больше было зараженных комаров. Однако, не исключено, что эта зависимость кажущаяся: коэффициент корреляции равен 0.62+0.32, а это значит, что вероятность независимости показателей велика (р>0.05).

 

Таблица 19. Зараженность комаров An. atroparvus бразильским штаммом Pl. vivax.

N опыта

Исследование на ооцисты

Исследование на спорозоиты

 

  день

  n 

     D

день

   n

        D

1

6 – 8             6

0   0¸40

22              6

0         0¸40

2

4 – 11          18

11   3¸33

20             18

11        3¸33

3

5 - 15           13

8   1¸33

14 - 19        13

8          1¸33

4

7 – 21          16

19   7¸43

24-26        16

19        7¸43

5

5 –11           20

10   3¸30

11             20

10          3¸30

6

5 - 8            11

9   2¸39

  -               11

9           2¸39

7

4 - 14            6

50   19¸81

10-22          6

50         19¸81

8

4 - 14            8

37   14¸69

20               8

37         14¸69

Все

6-14 8все                95

16   10¸24

все            95

16          10¸24

Обозначения: n - число исследованных особей, D - доля (%) зараженных особей и доверительный интервал этого показателя при р=0.05.

 

Из 98 вскрытых комаров с ооцистами было 15 (15 %). Число ооцист у зараженных комаров достигало 47 (в среднем 11). Из 47 комаров, вскрытых на наличие спорозоитов, инфицированными оказались 7 (15 %). Количество спорозоитов оценено в 1 и 2 балла.

Успешное развитие плазмодиев в комарах подтверждено фактом передачи: у пациентки после укусов 2 зараженных комаров (что было определено путем последующего их вскрытия) наблюдалась типичная клиника, и в крови обнаружены паразиты.

Сравнение заражаемости An. atroparvus разными штаммами P. vivax говорит о влиянии географического фактора: в нашем случае заразилось 15 % комаров, а симпатричными штаммами заражалось 24¸33 % (Тибурская, 1964, 1965).  И все же, завоз этого возбудителя в места распространения исследо­ванной популяции комаров, и, весьма вероятно, всего вида представляет эпи­демиологическую опасность (Daskova, 1977).

Возможность заражения An. atroparvus экзотическими штаммами плазмодиев подтвердили и другие исследователи (Джавадов и др., 1977; Teodorescu, 1983). Впоследствии восприимчивость комаров к экзотическим штаммам плазмодиев была обнаружена и у многих других видов комаров (Collins et all., 1986).

Поскольку аллопатричные штаммы плазмодиев связаны обычно с разными видами комаров и всегда с разными их популяциями, разница в их способности заражать местных и экзотических комаров вызвана адаптированностью к определенному переносчику. Эту мысль подтверждает и прямой эксперимент, изложенный в следующем разделе.

Если комары могут быть восприимчивы к экзотическим штаммам плазмодиев, то где гарантия того, что в один "прекрасный" момент они не окажутся переносчикам видов, с которыми вовсе не встречались?

 

Выводы

1. Географическая изоляция плазмодиев малярии от переносчиков, не гарантирует отсутствия их преадаптации.

2. Восприимчивость комаров к аллопатричному штамму плазмодиев ниже, чем к симпатричным штаммам.

3. Завоз P.  vivax в районы распространения An. atroparvus может привести к возникновению местных очагов малярии.

 

5.2. Адаптация возбудителя к переносчику.

Вопрос о влиянии переносчика на возбудителя выходит за рамки данной работы. Однако, в связи с проблемой восприимчивости, целесообразно изложить результаты опыта по влиянию способа пассирования возбудителя на его способность заселять переносчика.

 

Материалы и методы.

Опыт выполнен на комарах Ae.  aegypti и An. sacharovi, возбудителе P. gallinaceum и цыплятах.

Схема опыта. На первом этапе группу цыплят (4 штуки) заразили возбудителем малярии путем кормления на них Ae. aegypti, зараженных в ходе поддержания штамма плазмодиев. На втором - на одном из этих цыплят накормили 2 группы комаров (Ae. aegypti и An. sacharovi). На третьем этапе каждая группа комаров была накормлена на здоровых цыплятах. Тем самым цыплята были заражены; одни от Ae. aegypti, другие от An. sacharovi. на четвертом этапе из каждой группы взяли по одному цыпленку и на каждом из них накормили и Ae. aegypti и An. sacharovi. Так образовались 4 группы комаров: 1) Ae. aegypti, зараженные на цыплятах, донором возбудителя которых был этот же вид, 2) Ae. aegypti, зараженные на цыплятах, донором возбудителя которых был An. sacharovi, 3) An. sacharovi, зараженные на цыплятах, донором возбудителя которых был Ae. aegypti, 4) An. sacharovi, зараженные на цыплятах, донором возбудителя которых был этот же вид. Эти 4 группы комаров затем были исследованы на зараженность.

 

Результаты и обсуждение.

Зараженность комаров при пассировании через свой вид выше, чем через чужой (табл. 20). В наших опытах различия не велики, но они образовались всего лишь за одно половое поколение плазмодиев. Вероятно, что за многие тысячи поколений, в течение которых бывают разобщены популяции возбудителя, отбор среди них на адаптацию к определенному переносчику может зайти весьма далеко.

 

Таблица 20. Влияние пути передачи на заражение комаров P. gallinaceum.

Показатель

Путь передачи возбудителя

A-A

S-A

S-S

A-S

Число особей, исследован­ных на ооцисты

Ооцистный индекс (%)

31

61

30

40

37

62

37

49

Доверительный интервал ооцистного индекса (%)

Обилие ооцист

44¸76

19

25¸58

10

46¸76

136

33¸64

83

Число особей, исследован­ных на спорозоиты

Спорозоитный индекс (%)

30

60

37

32

20

55

24

33

Доверительный интервал спорозоитного индекса (%)

Ооцистно-спорозоитный индекс

42¸75

98

20¸48

81

34¸74

88

18¸53

33

Обозначения путей передачи возбудителя: A-A - от Ae. aegypti к Ae. ae­gypti; S-A - от An. sacharovi к Ae. aegypti; S-S - от An. sacharovi к An. sacharovi; A-S - от Ae. aegypti к An. sacharovi.

 

Вывод.

Пассирование плазмодиев через определенного переносчика повышает их способность заселять именно его.

 

5.3. Восприимчивость без коэволюции.

Причина жесткой связи возбудителей и переносчиков видится в том, что они возникают в процессе длительной коэволюции взаимодействующих организмов (Беклемишев, 1955). К началу наших работ было известно о способности плазмодиев "использовать" разные виды комаров (Bray, Garnham, 1964; Vandenberg, Yoeli, 1965; Garnham, 1966). Но это не опровергало указанного представления, т. к. возможность связи взаимодействующих видов в этих случаях не исключалась.

 

Таблица 21. Общая характеристика восприимчивости An. sacharovi и An. pulcherrimus к Pl. gallinaceum.

Показатель

Вид  комаров

An. sacharovi

An.pulcherrimus

Число опытов по заражению комаров  возбудителем

14

14

Число опытов, в которых комары заразились

14

14

Число опытов по передаче возбудителя от комаров цыплятам-реципиентам

 

9

 

5

Число опытов, в которых цыплята-реципиенты заразились возбудителем от комаров

 

8

 

4

Число циклов передачи возбудителя от комаров

7

8

 

Задача данного раздела - определить возможности возникновения эффективных ксено-пар для видов, контакт между которыми в природе невозможен. Это исследование имело не только теоретический интерес - мы стремились расширить круг лабораторных моделей циркуляции возбудителя малярии и приблизить модель к реальным процессам.

Как видно из последних обзоров (Алексеев, Кондрашова, 1985; Расницын, 1986) и других публикаций (Алексеев, Расницын, 1987; Захарова и др. 1988; Чернов, Чунина, 1988 и др.), в настоящее время чаще всего используется модель P. gallinaceum - Ae. aegypti. Но она плоха тем, что применяющийся в ней переносчик не участвует в циркуляции малярии человека. Этот недостаток мы стремились преодолеть, подобрав реального переносчиками малярии человека. Наша попытка основывалась на одном сообщении (Eyles, 1952), правда не подтвержденном, о заражении указанным возбудителем комаров An. freeborni и An. quadrimaculatus. Кроме того, был известен и другой случай заражения комаров "не свойственными" возбудителями (Vincke, 1967). Восприимчивыми оказались An. sacharovi и An. pulcherrimus, которые играют основную роль в действующих очагах малярии в Закавказье и Средней Азии (Артемьев, 1984).

 

Материалы и методы.

Оценка новых переносчиков проводилась путем сравнения с Ae. aegypti при одновременном кормлении их на одном и том же цыплёнке. Цыплята, на которых заражали комаров, имели паразитемию 2-3 балла по шкале А.И.Немировской. При заражении к каждому цыпленку подсаживали по 10 комаров (но кровь пили не все).

 

Результаты

Во всех опытах с обоими видами были обнаружены зараженные особи, в большинстве случаев они передавали возбудителя цыплятам. Передача подтверждена клинически, паразитологически (в мазках крови обнаружены типичные формы паразитов) и путем ксенодиагностики (путем обнаружения паразитов в комарах, накормленных кровью на цыплятах-реципиентах).

Для проверки возможности поддержания штамма возбудителя осуществлено несколько циклов циркуляции возбудителя с использованием каждого из иссле­дуемых видов комаров. Полученные данные обобщены в таблице 21. Неудачные случаи передачи вызваны, скорее всего, тем, что на цыплят нападали только незараженные особи. В этих опытах An. sacharovi были заражены на 18 % и на цыпленка напало 8 самок, а для An. pulcherrimus эти величины соответственно 22 % и 7 самок. В обоих случаях вероятность нападения только незараженных особей близка к 0.2. Не исключено, конечно, что в не заразившихся цыплят попало слишком мало спорозоитов - меньше минимально-необходимой дозы.

 

Таблица 21. Общая характеристика восприимчивости An. sacharovi и An. pulcherrimus к Pl. gallinaceum.

Показатель

Вид  комаров

An. sacharovi

An. pulcherrimus

Число опытов по заражению комаров  возбудителем

14

14

Число опытов, в которых комары заразились

14

14

Число опытов по передаче возбудителя от комаров цыплятам-реципиентам

 

9

 

5

Число опытов, в которых цыплята-реципиенты заразились возбудителем от комаров

 

8

 

4

Число циклов передачи возбудителя от комаров

7

8

 

An. sacharovi заражается реже Ae. aegypti (44 % против 70 %) и различия между ними не случайны (р=0.05). Но самое главное, что демонстрирует сравнение видов (рис. 4а), отсутствие корреляции в доле зараженных особей (R=0.22+30).

 

Рис. 4. Сопоставление экстенсивности заражения разных видов комаров ооцистами P. gallinaceum.

По оси абсцисс - доля (в %) заразившихся особей конт­рольного вида (Ae. aegypti).

По оси ординат - то же в параллельных группах эксперимен­тального вида.

А - Ae. aegypti и An. sacharovi.

Б - Ae. aegypti и An. pulcherrimus.

 

Обратную картину даёт сравнение интенсивности заражения. У An. sacharovi она выше, чем у Ae. aegypti. И опять же разница достоверна (р<0.01) и велика (в среднем в 4 раза). Повышенное обилие возбудителя у An. sacharovi нельзя объяснить повышенным количеством выпитой ими крови и, соответственно, числом заглоченных гаметоцитов. An. sacharovi выпивают кро­ви лишь немного больше, чем Ae. aegypti (2.8 мг против 2.2 мг). Как и по экстенсивности заражения, нет корреляции и в обилии ооцист у сравниваемых видов (R=0.35+0.29) (рис. 5а). Отсутствие кор­реляции не является, конечно, доказательством отсутствия какой бы то ни было связи вообще. В данном случае (рис. 4а) связь прослеживается: на фоне роста обилия ооцист у Ae. aegypti этот же показатель у An. sacharovi образует одновершинную кривую с пиком в районе 30-40 ооцист у Ae. aegypti.

 

Рис. 5. Сопоставление интенсивности заражения разных видов комаров ооцистами P. gallinaceum.

По оси абсцисс - среднее число ооцист у заразившихся особей контрольного вида (Ae. aegypti).

По оси ординат - то же в параллельных группах экспериментального вида.

А - Ae. aegypti и An. sacharovi.

Б - Ae. aegypti и An. pulcherrimus.

 

Сопоставление заражаемости An. pulcherrimus и Ae. aegypti (рис. 4б) показывает, что новый переносчик восприимчивее традиционного: число случаев превосходства его зараженности над зараженностью Ae. aegypti 9, а случаев обратного соотношения только три (вероятность случайной разницы р=0.05). В 9 опытах из 12 доля зараженных An. pulcherrimus превышала 50 %, а у Ae. aegypti таких результатов только 7.

Еще резче разница в интенсивности заражения (рис. 5б): обилие ооцист у An. pulcherrimus в большинстве опытов (57 %) превышало 100 и достигло 350, а у Ae. aegypti - ни разу не превысило 60. Разница сравниваемых видов не может объясняться ошибкой репрезентативности: ее вероятность слишком низка (р< 0.01). Ее нельзя связать и с количеством выпиваемой крови. Наоборот, An. pulcherrimus выпивают крови меньше, чем Ae. aegypti (1.4 против 2.2 мг). Своеобразие взаимоотношений сравниваемых видов переносчиков с одним и тем же видом возбудителя демонстрирует отсутствие корреляции в их заражении (по экстенсивности заражения R=0.53+0.15, а по интенсивности R=0.12+0.28).

На рис. 6 представлена зависимость обилия возбудителя в комарах от доли зараженных особей. Известно (Eyles, 1951), что у Ae. aegypti эта связь довольно четкая и имеет нелинейный характер. У каждого из новых видов характер зависимости между сравниваемыми показателями своеобразен и они отличаются как между собой, так и от Ae. aegypti. Для An. sacharovi зависимость близка к линейной (R=0.72+0.20) и описывается уравнением Y = 12 + 2.2X, где Х - доля (в %) зараженных особей, Y - среднее число ооцист у зараженных особей. У An. pulcherrimus линейная связь между указанными показателями невелика (R=0.49+0.25).

 

Рис. 6. Сопоставление экстенсивности и интенсивности за­ражения комаров ооцистами P. gallinaceum.

По оси абсцисс - доля  (в %) заразившихся особей.

По оси ординат - среднее число ооцист у заразившихся особей.

А - An. sacharovi.

Б - An. pulcherrimus.

 

Результаты экспериментов позволяют оценить сохраняемость возбудителя в переносчиках. Это сохранение можно измерить по изменению доли зараженных особей возбудителем на стадии ооцисты и на стадии спорозоита. Фактические данные показаны на рис. 7. У обоих видов оба показателя заражаемости хорошо коррелируют: для An. sacharovi R=0.71+0.16, для An. pulcherrimus R=0.73+0.40. Связь этих показателей описывается уравнением Z=2+0.7U (для An. Sacharovi) и Z = 2.5U - 181 (для An. pulcherrimus) , где Z - доля (в %) особей, имеющих ооцисты. Уравнения показывают, что к окончанию спорогонии зараженность исследованных видов резко снижается. Причина снижения может быть разной: то ли зараженные комары погибают в большем числе, чем не зараженные, то ли спорозоиты не всегда достигают слюнных желез. Но несомненно, что у сравниваемых видов эти процессы происходят с разной интенсивностью.

 

Рис. 7. Сохраняемость P. gallinaceum в экспериментальных видах комаров.

По оси абсцисс - доля (в %) особей, зараженных ооцистами плазмодия.

По оси ординат - доля (в %) особей, зараженных спорозои­тами плазмодия.

А - An. sacharovi.

Б - An. pulcherrimus.

 

Обсуждение результатов.

Полученные результаты доказывают возможность образования ксено-пар без длительной коэволюции. P. gallinaceum в естественных условиях не встречаются с An. sacharovi и An. pulcherrimus и по экологическим причинам (эти комары - охотники за крупной добычей, а P. gallinaceum паразит птиц), и по географическим (их ареалы далеки друг от друга), но при первом же контакте плазмодии заразили комаров. (Контакт этот был первым в буквальном смысле слова, т. к. в то время культур этих комаров ни у кого не было - они созданы нами впервые в мире - и, следовательно, никто не имел возможности проделать подобный опыт.) Этот факт много значит. В комарах происходит развитие, размножение и половой процесс споровика. Он проходят сквозь стенку кишки насекомого, живет в полости его тела, переходит в экскреторные железы, питается за счет его веществ. А раз образование новой ксено-пары возможно в случае таких тесных взаимоотношений, значит в других, более простых случаях, такое явление тем более вероятно. Полученные факты говорят о реальной угрозе появления новых переносчиков и новых возбудителей. Возможность возникновения новых ксено-пар подтверждена исследованиями, выполненными на других сочетаниях возбудителей и переносчиков (Graves, 1982; Fujita, 1986; Ichimori, 1989; Opiyo et all., 1988).

Во-вторых, данная работа показала пригодность An. sacharovi и An. pulcherrimus для лабораторного моделирования циркуляции P. gallinaсeum. Так как оба вида - переносчики малярии человека, их использование в модели приближает ее к нуждам эпидемиологии. Мировая новизна и полезность модели подтверждены авторским свидетельством об изобретении (Расницын, Званцов, Ясюкевич, 1991б).

В третьих, обнаруженные различия в заражаемости разных видов комаров одним и тем же возбудителем говорят о таком своеобразии отношений в каждой паре возбудителей, которые необходимо учитывать в эпидемиологических построениях.

Результаты экспериментов позволяют сделать также и два нецелевых заключения. Во-первых, поскольку ни в одном из многочисленных опытов не было отсутствия зараженных комаров, значит уровень паразитемии (2¸3 балла), с которым мы работали, превышает нижний порог.

Во вторых, подтверждены выводы предыдущих разделов: отсутствие прямой пропорциональности между заражаемостью разных переносчиков и уровня заражения с количеством выпиваемой крови. Это говорит о том, как мало значит число заглоченных паразитов и как велико влияние свойств переносчика.

 

Выводы.

1. Комары An. sacharovi и An. pulcherrimus способны заражаться возбудителем малярии P. gallinaceum  и передавать его позвоночному хозяину, хотя всякая возможность взаимной коодаптации на основе коэволюции в данных случаях была невозможна.

2. Имеются существенные различия в интенсивности и экстенсивности заражения представителей разных родов комаров одним и тем же видом возбудителя малярии и в выживаемости плазмодиев в их организме.

3. Комары An. sacharovi и An. pulcherrimus пригодны для лабораторного моделирования циркуляции возбудителя малярии P. gallinaceum. Поскольку оба вида комаров являются реальными переносчиками малярии человека, их использование в модели приближает получаемые результаты к реальным процессам.

4. Возникновение эффективных ксено-пар возможно без длительной коэволюции взаимодействующих организмов.

 

5.4. Сравнение восприимчивости разных видов.

Возможность заражения представителей одного рода комаров одним и тем же видом малярии считается само - собой разумеющейся. В руководствах и учебниках пишут: "возбудителя малярии [имеется в виду малярия человека. С.Р.] передают малярийные комары рода Anopheles."

Полевые данные ("анофелизм без малярии") давно уже наводили на мысль о разной векторной способности разных видов комаров. Многие исследователи (Boyd, Kitchtn, 1936; Young et all., 1946; Collins, 1962; Collins et all., 1963; Coathney, 1971) считали, что это может быть связано с различиями их восприимчивости.

Но это были косвенные данные. Прямое же сравнение давало неоднозначный ответ: в одних случаях разница между видами и даже разными штаммам одного вида то проявлялась (Huff, 1929; Boyd et all., 1938; Eyles, 1952; Jeffery et all., 1954; Kilama, Craig, 1969), подобно разнице в восприимчивости к вирусам (McLintock, 1978), а то нет (Boyd, Jobbins, 1940; Young, Burgess, 1948). А раз так, ничего предсказать невозможно - те виды, которые нас интересуют, надо испытывать.

В нашей стране таких испытаний не было, и данная работа (Dashkova, Rasnitsyn, 1982; Расницын, Ясюкевич, Званцов, 1990) - попытка заполнить указанный пробел.

Нам удалось сопоставить восприимчивость трех видов Anopheles группы An. maculipennis на реальной малярии человека P. vivax (Dashkova, Rasnitsyn, 1982). Кроме того, аналогичная работа проделана на лабораторных моделях: P. gallinaceum  с переносчиками из рода Aedes и Anopheles (Расницын, Ясюкевич, Званцов, 1990).

Кроме поиска ответа на поставленный вопрос, мы хотели расширить набор видов, используемых с P. gallinaceum. Хотя известно, что к этому возбуди­телю восприимчивы многие комары (Russel, Mohan, 1942; Демина, Левитанская, Авраменко, 1951; Garnham, 1966), в работе применяют только один - Ae. aegypti, что не позволяет учесть видовые особенности. Особенно привлекательным казался Ae. togoi. Этот вид очень удобен: комары крупные, хорошо нападают на доноров; методы культивирования его разработаны (Чагин, 1943; Wearthersby, 1962; Александрова, Тамарина, Резник, 1978; Trimble, Wellington, 1979; Ясюкевич, Расницын, 1990).

 

Материалы и  методы.

Исследования выполнены на реальной малярии человека (P. vivax и комары группы An. maculipennis) и на лабораторных моделях (P. gallinaceum  и комары из рода Aedes и Anopheles). С малярией человека проведен один опыт (объем материала приведен вместе с результатами). С Aedes проведено 15 опытов, в которых исследовано 690 Ae. togoi и 813 Ae. aegypti, с Anopheles - 9 опытов, в которых исследовано 265 An. sacharovi, 442 An. atroparvus, 260 Ae. aegypti и 448 Cx. pipi­ens.

Сравнение восприимчивости проведено путем сопоставления ооцистного индекса и обилия ооцист у сравниваемых видов, накормленных одновременно на одном и том же доноре. Только опыты на лабораторной модели Anopheles велись несколько иначе. Поскольку в них сравнивалась восприимчивость четырех видов, надо было накормить на одном доноре 4 группы комаров, но сделать это одновременно невозможно. Поэтому садки с комарами прикладывали к донору парами, какой вид попадал в какую пару, решалось каждый раз жребием, т. е. было равномерно случайным. Особенностью этой серии было также то, что сравнение видов одного рода сопровождалось контролем - представителями родов Aedes и Culex. Ae. aegypti был взят для того, чтобы быть уверенным, что у донора имеются жизнеспособные гаметоциты, т. к. этот вид заражается чаще, чем An. sacharovi, а Cx. pipiens - как контроль от супердиагностики. То, что Cx. pipiens не заражается P. gallinaceum  мы знали из предварительных специальных опытов; материал данных экспериментов подтвердил это еще раз.

 

Результаты и обсуждение.

 

Восприимчивость к P. vivax.

Сравнение восприимчивости видов группы maculipennis к P. vivax (табл. 22) показало, что у всех из них паразит достигает стадии ооцисты одинаково часто, но доля паразитов достигших стадии спорозоита различается. Ооцистно-спорозоитный индекс (т. е. процент комаров с ооцистами которые затем развились в спорозоиты) у An. messeae (21 %) был значительно ниже чем у An. atroparvus (62 %) и An. sacharovi (59 %) и эта разница не случайна (р<0.01). Обнаруженное различие может объясняться либо повышенным разрушением спорозоитов у An. messeae, либо их неспособностью достигать слюнных желез. (То, что не все спорозоиты попадают в слюнные железы, показано Collins W. E. et all. (1976)). Но, так или иначе, восприимчивость этих видов не идентична.

 

Таблица 22.  Заражаемость разных видов комплекса An. maculipennis одним и тем же штаммом Pl. vivax.

Показатели

Вид комаров

An.

atroparvus

An.

messeae

An.

sacharovi

Число особей, исследован­ных на ооцисты

62

201

42

Ооцистный индекс (%)

34

24

29

Доверительный интервал ооцистного индекса (%)

23¸46

18¸30

17¸44

Обилие ооцист

6.4

7.3

7.2

s обилия ооцист (%)

8.7

10.5

10.4

Число особей, исследован­ных на спорозоиты

26

142

23

Спорозоитный индекс (%)

8

15

17

Доверительный интервал спорозоитного индекса (%)

2¸24

10¸22

7¸37

Доля (в %) выживших макрогаметоцитов

0.31

0.35

0.39

Выживание плазмодиев в течение спорогонии (%)

21

62

59

 

Имеющийся материал не выявил различий между восприимчивостью An.  atroparvus и An. sacharovi, но это не служит доказательством их идентичности - дело может быть в том, что материал, который удалось набрать по малярии человека слишком мал (всего 1 опыт).

 

Восприимчивость к P. gallinaceum.

Исследованная линия Ae. togoi оказалась высоко восприимчивой: во всех 15 опытах были зараженные особи, все 6 попыток заразить через него хозяина окончились успешно. (Специальных опытов по передаче возбудителя через Ae. aegypti мы не ставили, так как эта способность хорошо известна. В частности, имеющийся штамм P. gallinaceum поддерживается с использованием перевивки через комаров этого вида. За последние 2 года такая перевивка успешно осуществлялась не менее 100 раз.) Спорозоитный индекс у Ae. togoi в среднем лишь на 8 % ниже ооцистного, что говорит о высокой выживаемости плазмодиев.

Ae. togoi заражаются чаще, чем Ae. aegypti, и обилие ооцист у них выше (табл. 23). Вероятность того, что эти различия случайны, очень мала (p=0.000003). Повышенную заражаемость Ae. togoi нельзя объяснить повышенным количеством заглоченных возбудителей. Они выпивают только в 2 раза больше крови (4.6+0.3 мг против 2.2+0.2 мг Ae. aegypti), а обилие ооцист у них выше в десятки и сотни раз. Это значит, что зараженность определяется не только и не столько обилием заглоченных возбудителей, а другим фактором или факторами. (Тем самым подтверждается вывод, сделанный в предыдущем разделе.)

 

Таблица 23. Сравнение заражаемости Ae. aegypti и Ae. togoi возбудителем малярии Pl. gallinaceum.

Показатель

Вид комаров

Ae. aegypti

Ae. togoi

Число опытов

Доля опытов, в которых были получены зараженные особи, %

Доля опытов, давших заражение более 50% комаров, %

Доля опытов, в которых среднее обилие ооцист было выше 50, %

Доля опытов, в которых среднее обилие ооцист было выше 100, %

Число заражавшихся цыплят

Доля заразившихся цыплят, %

15

100

27

 

0

 

0

0

-

15

100

73

 

60

 

33

6

100

 

У Ae. togoi, так же как у Ae. aegypti (Алексеев, Расницын, 1987; Расницын, Жарова, 1985), наблюдается высокая степень корреляции (R=0,95±0.03) между зараженностью особей возбудителем на стадии ооцисты и на стадии спорозоита (рис. 8). В исследованном диапазоне от 40 до 100 % характер зависимости описывается уравнением: y=1.2x - 25.2, где y - доля особей, зараженных возбудителем на стадии спорозоита, x - то же на стадии ооцисты. На рисунке и в математическом описании зависимости видно, что абсолютное значение потери возбудителя в комарах не зависит от доли зараженных особей. Это значит, что при низкой зараженности она происходит чаще, чем при высокой.

 

Рис. 8. Сопоставление зараженности комаров Ae. togoi оо­цистами и спорозоитами P. gallinaceum.

По оси абсцисс - доля (в %) особей, имевших ооцисты.

По оси ординат - доля (в %) особей, имевших спорозоиты.

 

У Ae. togoi не обнаруживается прямолинейной связи между долей зараженных особей и интенсивностью заражения (измеряемой числом ооцист). Коэффициент корреляции всего лишь 0.57±0.17. Как видно из рис. 9, прямолинейная связь имеется лишь при зараженности в диапазоне от 40 до 80 % (R=0.86±0.26), но при высокой доле зараженных особей прямолинейный ха­рактер зависимости нарушается из-за большого числа групп с очень высоким обилием ооцист.

 

Рис. 9. Сопоставление экстенсивности и интенсивности за­ражения комаров Ae. togoi ооцистами P. gallinaceum.

По оси абсцисс - доля  (в %) заразившихся особей.

По оси ординат - среднее число ооцист у заразившихся особей.

 

У Ae. aegypti связь между долей зараженных и обилием возбудителя ближе к прямолинейной (R=0.76±0.18), вероятно потому, что не было случаев с заражаемостью близкой к 100 % (максимум 88 %).

Самое же главное – заражаемость сравниваемых видов не коррелирует (рис. 10 и 11). По доле зараженных особей R=0.39±0.22, а по обилию ооцист R= - 0.11±0.26.

 

Рис. 10. Сопоставление экстенсивности заражения Ae. ae­gypti и Ae. togoi ооцистами P. gallinaceum.

По оси абсцисс - доля (в %) заразившихся особей Ae. ae­gypti.

По оси ординат - то же в параллельных группах Ae. togoi.

 

Рис. 11. Сопоставление интенсивности заражения Ae. ae­gypti и Ae. togoi ооцистами P. gallinaceum.

По оси абсцисс – среднее число ооцист у заразившихся особей Ae.  ae­gypti.

По оси ординат - то же в параллельных группах Ae. togoi.

 

При сравнении восприимчивости представителей рода Anopheles к P. gallinaceum результаты были особенно неожиданными. Хотя мы взяли таксономически очень близкие виды (An. atroparvus и An. sacharovi - виды-двойники) и перепробовали все реальные уровни паразитемии донора (табл. 24) один из них заражался, а другой - нет (табл. 25). Полученные данные позволяют од­нозначно заключить, что использованные в опытах популяции комаров An. atroparvus и Cx. pipiens не способны заражаться испытанным штаммом P. gallinaceum. Девять опытов, в которых комары контрольных видов заражались в самой разной степени и в которых исследовано более 400 особей не дали ни одного случая заражения. Надо отметить, что мы и ранее неоднократно пытались заразить эти виды комаров этим же возбудителем. Результат всегда был отрицателен, но, поскольку предыдущие опыты не сопровождались тщательным контролем, не было уверенности в том, что результат не вызван какими-либо сторонними причинами. Теперь таких сомнений нет. (Не исключено, что невосприимчивость - свойство данных видов в целом, но делать такой вывод на основании свойств лишь одной популяции преждевременно.)

 

Таблица 24. Объем исследованного материала.

N опыта

Паразитемия

Число исследованных особей

Ae. aegypti

An. atroparvus

An.  sacharovi

Cx. pipiens

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Все

1.0

2.0

2.0

2.5

2.5

3.0

3.5

3.5

4.0

-

34

26

23

25

29

29

34

34

28

260

47

49

50

50

50

50

46

47

53

442

33

33

32

25

25

26

26

30

35

265

47

53

47

45

50

50

46

48

52

448

 

Таблица 25. Заражаемость разных видов комаров возбудителем малярии Pl. gallinaceum.

N

опыта

Вид комаров и показатель зараженности

Ae. aegypti

An. atroparvus|

An. sacharovi

Cx. pipiens

    ОИ         |   00

    ОИ         |   00

    ОИ         |   00

    ОИ         |   00

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Все

  6    2¸20       7

83  63¸93      31

96  81¸99      39

56  37¸73      27

83  65¸92      30

83  65¸92      33

50  34¸66      20

79  63¸90      38

54  36¸70      32

65  59¸70      27

0      0¸6      0

0      0¸6      0

0      0¸6      0

0      0¸6      0

0      0¸6      0

0      0¸6      0

0      0¸6      0

0      0¸6      0

0      0¸6      0

0      0¸6      0

24   13¸41     15

97   84¸99     95

82   66¸91   106

52   33¸70     92

68   48¸83     80

54   37¸71     76

62   43¸76     99

67   49¸81     84

74   58¸86     46

69   63¸74     77

0      0¸6      0

0      0¸6      0

0      0¸6      0

0      0¸6      0

0      0¸6      0

0      0¸6      0

0      0¸6      0

0      0¸6      0

0      0¸6      0

0      0¸6      0

Обозначения: ОИ - ооцистный индекс и доверительный интервал этого показателя; ОО - обилие ооцист.

 

Кроме различий в восприимчивости разных видов полученные данные выявили также отсутствие связи восприимчивости с таксономической близостью видов. Из видов-двойников (An. sacharovi и An. atroparvus) одним и тем же штаммом плазмодия заражается только один. Но этим же штаммом заражаются представители другого рода. Правда, количественные характеристики их восп­риимчивости не совпадали: доля заразившихся Ae. aegypti была обычно выше, чем An. sacharovi, а интенсивность заражения ниже (p<0.001). Как и в слу­чае с Ае. togoi, зараженность не коррелировала (табл. 26.).

 

Таблица 26. Статистическая связь между заражаемостью комаров и уровнем паразитемии у донора возбудителя малярии Pl. gallinaceum, а также между со­бой.

Сопоставляемые показатели

R±mR

Паразитемия донора и ОИ Ae. aegypti

Паразитемия донора и ОО Ae. aegypti

Паразитемия донора и ОИ An. sacharovi

Паразитемия донора и ОО An. sacharovi

ОИ Ae. aegypti и ОИ An. sacharovi

ОО Ae. aegypti и ОО An. sacharovi

ОИ Ae. aegypti и Ae. aegypti

ОИ An. sacharovi и ОО An. sacharovi

0.48±0.33

0.51±0.33

0.59±0.31

0.28±0.36

0.67±0.28

0.37±0.35

0.94±0.13

0.91±0.16

Обозначения: R±mR - коэффициент корреляции и его ошибка репрезентатив­ности при р=0.05; ОИ - ооцистный индекс; ОО - обилие ооцист.

 

На примере данного исследования бросается в глаза отсутствие корреляции между таксономической близостью видов и их восприимчивостью: Ae. aegypti и An. sacharovi (представители разных родов) могут воспринимать (и, как далее будет показано, обеспечивать полный цикл развития и передачу) P. gallinaceum, а An. atroparvus (вид-близнец An. sacharovi) даже не заражается.

Хотя два представителя разных родов комаров и воспринимали один и тот же вид плазмодиев, количественные характеристики их зараженности не совпадали. Доля заразившихся Ae. aegypti была обычно выше, чем доля заразившихся An. sacharovi (впрочем, эта разница статистически не достоверна, р>0.05). А вот интенсивность заражения An. sacharovi всегда была много выше интенсивности заражения Ae. aegypti (и сомневаться в этой разнице не приходится - вероятность того, что она вызвана ошибкой репрезентативности p<0.001). Зараженность сравниваемых видов отличалась не только количественными показателями, она и не коррелировала (табл. 25.). Как, впрочем, не было выявлено статистической связи между уровнем паразитемии донора и показателями зараженности каждого из видов комаров. При этом связь между экстенсивностью и интенсивностью заражения проявилась и у Ae. aegypti, и у An. sacharovi.

Конечно, в иных случаях коррелятивная связь между таксономическими критериями и отношением к ксеноорганизму может и проявиться, но ценность приведенного результата в том, что он показывает, что подобная корреляция возможна не всегда.

Как показали многочисленные исследования выполненные позднее на самых разных сочетаниях возбудителей и переносчиков, видовые и, более того, штаммовые различия восприимчивости - общее правило (Jones, Foster, 1978; Beaty et all., 1979; Duhrkopf, Trpis, 1980; Fujita, 1986 ; Moloo, Kutuza, 1988; Perlowagora-Szumlewicz et all., 1988).

Полезно отметить, что своеобразие реакции разных видов комаров на микроорганизмы проявляется не только в отношении плазмодиев. Аналогично, большие различия, не коррелирующие с таксономической близостью видов, выявлены и в реакции на энтомопатогенных бактерий (Расницын, Войцик, Ясюке­вич, 1991; Расницын, Ясюкевич, Войцик, 1992).

 

Выводы.

1. Внутри семейства Culicidae нет корреляции между таксономической близостью видов и их восприимчивостью к плазмодиям малярии: виды одного рода могут различаться по этому свойству сильнее, чем представители разных родов; вплоть до того, что один из видов-двойников, может быть высоко восприимчив, а другой полностью рефрактерен.

2. Во всех случаях обнаружены различия между восприимчивостью разных видов. Не найдено ни одной пары видов, восприимчивость которых можно было бы считать идентичной или, хотя бы, коррелирующей.

 

5.5. Обзор данных о восприимчивости комаров России и сопредельных стран к экзотическим видам и штаммам плазмодиев.

Поскольку, как было показано выше, в настоящее время нет признаков, позволяющих предсказать восприимчивость определенных видов, для определения опасности завоза в нашу страну экзотических видов и штаммов малярии было предпринято специальное исследование на реальном материале. Основной целью было предвидеть последствия завоза, как это делается в других странах (Games, 1931; Shute, Maryon, 1951; Collins, et all., 1973, 1975; de Zulueta et all., 1976). Кроме того, определение восприимчивости комаров к экзотическими видами и штаммами возбудителей позволяет оценить влияние таксономии и географии на возможность восприимчивости в реальных случаях малярии человека.

До начала наших работ (Dashkova, Rasnitsyn, 1982) были лишь 2 публикации, касающиеся одного вида плазмодиев из одной географической точки (Тибурская, 1962, 1965), которые показали возможность переноса трех штаммов P. vivax из юго-восточной Азии комарами An. atroparvus.

 

Материалы и методы.

В работе использованы комары из лабораторных колоний (An. atroparvus и An. sacharovi) и взятые из природы (An. messeae и An. subalpinus). Выбор указанных видов определен их значением - они наиболее эффективные переносчики местной малярии. Возбудителей получали от людей, приехавших из-за рубежа. Чаще всего комаров заражали возбудителем венозной кровью больного путем искусственного кормления, но иногда и путем непосредственного кормления на доноре (естественно, только лабораторные штаммы и с согласия донора). Перед самым кормлением комаров кровь, которую они должны были пить, брали на анализ.

 

Результаты и обсуждение.

Результаты изучения восприимчивости комаров к завозным штаммам P. vivax (табл. 27) показывают, что все они способны заражаться указанным видом плазмодия из любой точки его ареала. Поскольку P. vivax имеет широкий круг переносчиков (Garnham, 1966), можно предполагать, что и другие виды комаров нашей фауны, восприимчивые к местным P. vivax, будут передавать и экзотические штаммы. Значит, завоз этого возбудителя опасен.

 

Таблица 27. Заражение комаров фауны России и сопредельных стран экзоти­ческими штаммами Pl. vivax.

Источник штамма плазмодия

N

Обилие гаметоцитов

Ооцисты

Спорозоиты

микро

макро

n

ОИ

n

СИ

 

An. sacharovi

 

Лаос

2

144¸220

132¸325

41

29

23

17

 

An. atroparvus

 

Лаос

3

70¸220

139¸325

67

34

28

7

 

An. messeae

 

Нигерия

1

30

51

33

12

41

7

 

Индия

2

71¸96

134¸170

38

13

8

12

 

Пакистан

3

17¸44

32¸90

43

5

40

5

 

Йемен

13

12¸325

325¸541

21

25

275

15

 

Лос

5

63¸220

123¸325

273

24

134

15

 

Бразилия

8

49¸555

55¸230

98

15

46

14

Примечание: Обилие гаметоцитов приведено по их числу на микролитр. В случае нескольких опытов с одним штаммом указаны предельные значения этого показателя.

Обозначения: N - число опытов, n - число исследованных особей, ОИ - оо­цистный индекс (доля в % комаров, имеющих ооцисты); СИ - спорозоитный индекс (доля в % комаров, имеющих спорозоиты)

 

Сравнение развития различных штаммов P. vivax в одних и тех же видах комаров выявило достоверные количественные различия в их адаптации к переносчикам. Следовательно, можно ожидать, что разные его штаммы будут "осваивать" разные виды переносчиков с разной скоростью.

Оценка восприимчивости к P. falciparum (табл. 28 и 29) показала, что An. atroparvus и An. messeae не заражаются штаммами этого плазмодия из Африки и юго-восточной Азии. Как не заражаются ими популяции An. atroparvus из западной Европы (Shute, Maryon, 1951; de Zulueta et al., 1976). Заражение An. sacharovi и An. subalpinus, хотя и редко, но возможно. Это подтвердили и другие исследователи (Джавадов и др., 1978). Такие данные говорят об опасности завоза этого возбудителя на Кавказ.

 

Таблица 28. Заражение комаров An. subalpinus и An. sacharovi фауны Рос­си и сопредельных стран экзотическими штаммами Pl. falciparum.

Источник штамма плазмодия

N

Обилие гаметоцитов

Ооцисты

Спорозоиты

микро

макро

n

ОИ

n

СИ

An. subalpinus

Центр. Африка

1

29

48

0

-

4

25

An. sacharovi

Верхняя Вольта

2

13¸14

26¸28

35

0

22

0

Гана

1

30

48

14

0

7

0

Центр. Африка

6

13¸29

13¸48

17

0

30

20

Либерия

1

3

8

5

60

0

-

Конго

2

26

90

15

0

18

0

Заир

1

+

+

0

-

5

0

Гвинея-Биссау

6

5¸19

5¸48

43

2

31

0

Мали

4

8¸12

8¸25

32

0

19

0

Экв.Гвинея

1

17

51

9

0

4

0

Индия

1

+

+

10

0

8

0

Пакистан

1

+

+

11

0

11

0

Примечание и обозначения как в таблице 26.

 

Таблица 29. Заражение комаров An. atroparvus и An. messeae фауны России и сопредельных стран экзотическими штаммами Pl. falciparum.

Источник штамма плазмодия

N

Обилие гаметоцитов

Ооцисты

Спорозоиты

микро

макро

n

ОИ

n

СИ

An. atroparvus

Мали

7

7¸12

8¸25

214

0

246

0

Гвинея-Биссау

5

6¸60

5¸48

172

0

129

0

Гвинея

1

+

+

36

0

29

0

Берег Сл. Кости

1

48

36

33

0

22

0

Верхняя Вольта

2

13¸40

26¸28

86

0

60

0

Гана

1

30

40

51

0

31

0

Центр. Африка

2

13¸27

13¸27

50

0

46

0

Того

1

24

42

37

0

24

0

Сомали

2

38¸71

50¸114

65

0

38

0

Замбия

1

11

11

33

0

25

0

Экват. Африка

5

17¸62

33¸132

107

0

114

0

Конго

2

10¸26

20¸90

75

0

46

0

Индия

2

12

22

45

0

44

0

Пакистан

1

+

+

49

0

31

0

An. messeae

Мали

4

8¸12

8¸25

63

0

58

0

Гвинея-Биссау

3

6¸12

5¸18

62

0

53

0

Гвинея

1

+

+

27

0

21

0

Верхняя Вольта

2

13¸14

26¸28

39

0

38

0

Гана

1

30

46

19

0

18

0

Центр. Африка

2

13¸27

13¸27

29

0

19

0

Экват. Гвинея

1

17

51

10

0

7

0

Конго

1

26

90

26

0

7

0

Индия

1

+

+

22

0

16

0

Пакистан

1

+

+

18

0

16

0

Примечание и обозначения как в таблице 26.

 

Подобные результаты (различная восприимчивость к разным штаммам P. falciparum) были получены и с другими видами комаров (Games, 1931; Shute, Maryon, 1951). Причина, несомненно, в больших различиях штаммов этого плазмодия. И, вообще, P. falciparum очень неоднороден (Лысенко, Бароян, 1979). Не исключено, что под одним названием скрывается не один вид. Может быть, изучение восприимчивости комаров к различным штаммам P. falciparum послужит средством их диагностики.

Изучение восприимчивости комаров к P. ovale и экзотическим штаммам P. malariae проведено в небольших объемах т. к. завоз их в СССР происходит редко. Во всех опытах (табл. 30) развития этих паразитов в An. atroparvus не было.

 

Таблица 30. Заражаемость An. atroparvus фауны России и сопредельных стран экзотическими штаммами Pl. ovale и Pl. malariae.

Источник штамма плазмодия

N

Обилие гаметоцитов

Ооцисты

Спорозоиты

микро

макро

n

ОИ

n

СИ

Pl. malariae

Гвинея

1

25

33

10

0

21

0

Pl. ovale

Мали

1

9

13

27

0

24

0

Танзания

1

30

40

31

0

32

0

Мозамбик

1

20

30

29

0

16

0

Центр. Африка

1

12

24

68

0

27

0

Гвинея

2

9¸14

14¸18

41

0

50

0

Примечание и обозначения как в таблице 26.

 

Заключение.

Основной результат работы - выявление реального положения с опас­ностью завоза малярии на территорию нашей страны (Бибикова, 1973; Дашкова, 1977; Dashkova, Rasnitsyn, 1982).

Кроме того, получено подтверждение возможной восприимчивости комаров к экзотическим штаммам плазмодиев. Показано также, что степень преадаптации разных штаммов возбудителя по отношению к разным видам комаров (точнее их популяциям) выражена в разной степени. Такие данные свидетельствуют о том, что переносчиком плазмодиев малярии человека может стать любой вид Anopheles. Но происходить это будет с разной скоростью. В некоторых парах (например, P. vivax и. An. atroparvus) отбора не потребуется или он займет лишь несколько поколений, в других (например, P. falciparum и An. sacharovi) потребует больше времени, а в третьих (например, P. falciparum и An. atroparvus) этот процесс будет столь длительным, что говорить о реальной опасности не приходится.

 

Выводы.

1. Комары способны заражаться экзотическими штаммами возбудителей малярии, но для разных видов комаров в отношении разных видов плазмодиев эта способность различна.

2. Исследованные виды комаров воспринимают штаммы P. vivax из всех частей ареала этого плазмодия.

3. An.  atroparvus,  An. messeae не заражались экзотическими штаммами P. falciparum.

4. An.  sacharovi воспринимал лишь некоторые из экзотических  штаммов P. falciparum.

5. Случаев заражения комаров An. atroparvus плазмодиями P. ovale и P. malariae не было.

6. P. falciparum неоднороден. Не исключено, что под этим названием скрывается не один вид. Изучение восприимчивости комаров к различным штаммам этого плазмодия может послужить средством их диагностики.

 

Заключение главы 5.

Связь между таксономическим положением возбудителей и переносчиков прослеживается лишь в отношении высших таксономических категорий. При этом принадлежность членистоногого к определенной таксономической группе не является свидетельством того, что оно восприимчиво к соответствующей группе возбудителей, а лишь того, что эту восприимчивость нельзя исключить без проверки.

На уровне родов и видов внутри семейства Culicidae по отношению к гемоспоридиям нет связи между таксономической близостью видов и их восприимчивостью, какая наблюдается, например, у клещей по отношению к боррелиям (Филиппова, 1990). Виды одного рода могут различаться по этому свойству сильнее, чем виды из разных родов; вплоть до того, что один из видов-двойников, может быть высоко восприимчив, а другой рефрактерен. Во всех случаях обнаружены различия между восприимчивостью разных видов комаров к одним и тем же штаммам плазмодиев малярии. Аналогично, наблюдаются видовые различия восприимчивости комаров и к вирусам (McLin­tock, 1978). Во всех случаях обнаружены различия между восприимчивостью разных видов комаров к одним и тем же штаммам плазмодиев малярии. Единственная закономерность - связь возбудителей малярии человека с представителями рода Anopheles.

Географическая изоляция штаммов возбудителей от популяций членистоногих, не гарантирует отсутствия восприимчивости. Наличие восприимчивости (т.е. адаптации возбудителя к переносчику) возможно в случае видов членистоногих и микроорганизмов (конкретно, комаров и гемоспоридий), которые в естественных условиях встречаться не могли, а, значит, между которыми не мог проходить процесс длительной коэволюции взаимодействующих организмов. Указанная способность позволила создать новую модель циркуляции возбудителя малярии, в которой использованы комары - реальные переносчики этой болезни среди людей. Благодаря чему эта модель ближе к реальным эпидпроцессам.


Глава 6. ИНДИВИДУАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВОСПРИИМЧИВОСТИ.

 

Индивидуальная изменчивость свойственна всем характеристикам всех живых организмов от вирусов (Верета, Воробьева, 1990) до млекопитающих (Яблоков, 1966), в том числе и насекомым (McDonald, Overland, 1974; Качаворян, Тертерян, 1983), и плазмодиям (McBride, Walliker, 1982; Collins et all., 1986), и другим паразитам (Thompson, Limbery, 1988). Изменчивость комаров изучалась во всех, казалось бы, мыслимых аспектах: генетическая (Aslamkhan et all., 1972; Стегний и др., 1976; Tadei, 1980; Kasule, Cook, 1988), морфологическая (Зуйтин, 1926; Пархоменко, 1981; Beckett, Townson, 1982), физиологическая (Тамарина, 1972; Vandehey et all., 1979), по реакции на инсектициды (Некрасова, 1989), даже по способности переносить голодание (Расницын, Ясюкевич, 1988; Juliano, 1989). В отношение же восприимчивости к плазмодиям исследовались различия морфологических форм (Collins et all., 1979). На возможность индивидуальной изменчивости восприимчивости внимания не обращали. Разный уровень зараженности особей объяснялся видовыми и штаммовыми особенностями плазмодиев и разным их числом, попавшим в определенную особь (Boyd, 1940; James, 1931; James et al., 1932). На примере многих симбионтов известно (Кеннеди, 1978), что "зараженность" хозяев неравномерна. Это же относится и к комаром с плазмодиями. Хотя разброс зараженности комаров виден во всех работах (где приводятся соответствующие данные), он не привлекал внимания. Но знание характера распределения зараженности особей переносчика необходимо для понимания эпидемического процесса.

 

6.1. Распределение возбудителей среди переносчиков.

Ранее изучением индивидуальной изменчивости заражения комаров плазмодиями занимались лишь C.G. Huff (1929) и E. Eyles (1951). Они обратили внимание на то, что она высока и не соответствует биномиальному распределению и его производным - нормальному распределению и распределению Пуассона. Причин, которые могли это вызвать, они не касались.

Задача данного исследования состояла в том, чтобы определить характер распределения возбудителей между особями переносчика и выявить, как это связано с распределением возбудителей в крови донора.

 

Материалы и методы

В работе использованы Ae. aegypti, An. sacharovi и Pl. gallinaceum. Схема опытов: Партию комаров делили на две группы, каждую из которых кормили одной и той же кровью, но одна из них (группа "Е") пила ее из цыпленка, а вторая (группа "И") - искусственно (по методу, описанному ранее). В первой серии опытов кровь в кормушке была разбавлена только консервантом, который составлял 20 % к взятой крови, а во второй, кроме того, физиологическим раствором в 10 раз. Кровь в кормушках тщательно перемешивали. Объем материала и уровень паразитемии доноров возбудителя приведен в таблице 31.

 

Таблица 31. Объем исследованного материала и уровень паразитемии доноров возбудителя.

серия

опытов

N

опыта

Вид комаров

П

nе

nи

1

1

1

1

1

1

1

2

3

4

5

6

Ae. aegypti

Ae. aegypti

Ae. aegypti

An. sacharovi

An. sacharovi

An. sacharovi

2.5

2.0

2.0

2.5

2.5

2.0

165

140

81

119

72

51

195

142

125

175

83

108

2

2

2

2

2

2

1

2

3

4

5

6

Ae. aegypti

Ae. aegypti

Ae. aegypti

Ae. aegypti

Ae. aegypti

Ae. aegypti

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

21

18

10

18

18

22

16

36

16

32

32

40

Обозначения: П - паразитемия донора, nе - число исследованных особей при естественном кормлении кровью, nи - число исследованных особей при ис­кусственном кормлении кровью.

 

Результаты и обсуждение.

Фактические результаты приведены в таблицах 32 и 33. При искусственном кормлении и интенсивность, и экстенсивность заражения комаров несколько снижены. Этому надо верить, т. к. различия обнаружены во всех шести опытах и, значит, вероятность случайного совпадения около 0,15.

 

Таблица 32. Зараженность Ae. aegypti при разных способах дачи крови.

Показатель

Способ кормления кровью

Номер опыта

1

2

3

Доля зараженных особей

Е

И

88

57

97

73

81

54

Доверительный интервал доли зараженных особей

Е

И

82¸92

50¸64

93¸99

65¸80

72¸88

46¸63

Среднее число ооцист у всех особей

Е

И

25

7

54

10

9

5

Коэффициент вариации предыдущего показателя

Е

И

123 %

210 %

63 %

140 %

127 %

106 %

Среднее число ооцист у зараженных особей

Е

И

28

12

55

14

12

10

Коэффициент вариации предыдущего показателя

Е

И

110 %

145 %

60 %

108 %

186 %

120 %

Медиана числа ооцист у всех особей

Е

И

13

1

52

5

6

1

Медиана числа ооцист у зараженных особей

Е

И

18

5

53

8

7

6

Максимальное число ооцист

Е

И

141

106

174

75

67

71

Примечание: Все доли приведены в %.

Обозначения: Е - естественное кормление кровью, И - искусственное корм­ление кровью.

 

Таблица 33. Зараженность An. sacharovi при разных способах дачи крови.

Показатель

Способ кормления кровью

Номер опыта

1

2

3

Доля зараженных особей

Е

И

52

48

60

54

80

78

Доверительный интервал доли зараженных особей

Е

И

43¸61

41¸55

48¸70

44¸64

68¸89

69¸85

Среднее число ооцист у всех особей

Е

И

65

44

54

41

105

87

Коэффициент вариации предыдущего показателя

Е

И

223 %

267 %

211 %

186 %

125 %

146 %

Среднее число ооцист у зараженных особей

Е

И

129

112

100

80

156

118

Коэффициент вариации предыдущего показателя

Е

И

154 %

147 %

182 %

158 %

90 %

95 %

Медиана числа ооцист у всех особей

Е

И

9

0

44

7

23

15

Медиана числа ооцист у зараженных особей

Е

И

61

26

62

33

48

19

Максимальное число ооцист

Е

И

277

282

235

216

332

250

Примечание: Все доли приведены в %.

Обозначения: Е - естественное кормление кровью, И - искусственное корм­ление кровью.

 

Анализ характера распределения плазмодиев у комаров (рис. 12 - 14) показал, что перемешивание крови в кормушке не способствует равномерности заражения, а разбавление крови дало результат, противоположный ожидаемому, - привело к повышению вариабельности (табл. 34). Распределение комаров по уровню зараженности не соответствует биномиальному распределению. Об этом свидетельствует большая разница между фактической долей незараженных особей и ее математическим ожиданием для нормального распределения (табл. 35). Причины этому могло быть две: плазмодии в крови собраны в группы и (или) разные особи комаров отличаются по уровню восприимчивости. Первая причина отпадает - перемешивание крови в кормушке не снижает вариабельности. Значит дело в неравной восприимчивости особей. Это подтверждает и совпадение фактического положения с негативным биномиальным распределением. Это распределение соответствует именно тем случаям, когда математическое ожидание событий не фиксировано в пределах совокупности (Бреев, 1972), в нашем случае, когда вероятность заражения разных особей различна.

 

Рис. 12. Распределение комаров Ae. aegypti по числу ооцист P. gallinaceum. (Опыт N 1.)

По оси абсцисс - класс по числу ооцист (под столбцом указано среднее значение класса).

По оси ординат - частоты классов в % от общего числа случаев.

Обозначения: заштрихованный столбик - комары, пившие кровь на доноре; не заштрихованный столбик - комары, пившие кровь того же донора из кормушки.

 

Рис. 13.  Распределение комаров Ae. aegypti по числу ооцист P. gallinaceum. (Опыт N 2.)

По оси абсцисс - класс по числу ооцист (под столбцом указано среднее значение класса).

По оси ординат - частоты классов в % от общего числа случаев.

Обозначения: заштрихованный столбик - комары, пившие кровь на доноре; не заштрихованный столбик - комары, пившие кровь того же донора из кормушки.

 

Рис. 14.  Распределение комаров Ae. aegypti по числу ооцист P. gallinaceum. (Опыт N 3.)

По оси абсцисс - класс по числу ооцист (под столбцом указано среднее значение класса).

По оси ординат - частоты классов в % от общего числа случаев.

Обозначения: заштрихованный столбик - комары, пившие кровь на доноре; не заштрихованный столбик - комары, пившие кровь того же донора из кормушки.

 

Таблица 34. Зараженность Ae. aegypti при естественном кровососании и искусственном кормлении разбавленной кровью.

Показатель

К

Номер опыта

1

2

3

4

5

6

Доля зараженных особей

Е

И

57

6

28

3

60

6

83

25

56

29

73

20

Доверительный интервал доли зараженных осо­бей

Е

И

36 ¸ 76

1 ¸ 28

12 ¸ 51

1 ¸ 14

31 ¸ 83

1 ¸ 28

61 ¸ 94

13 ¸ 42

34 ¸ 75

16 ¸ 45

57 ¸ 90

10 ¸ 35

Среднее число ооцист у всех особей

Е

И

7.6

0.1

0.4

0.0

12.4

0.1

27.8

0.5

7.4

1.4

11.7

1.0

Коэффициент ва­риации предыду­щего показателя

Е

И

179 %

400 %

193 %

600 %

160 %

400 %

145 %

306 %

192 %

289 %

139 %

321 %

Среднее число ооцист у зара­женных особей

Е

И

13.3

1.0

1.6

1.0

20.7

1.0

33.3

2.1

13.3

5.1

15.1

4.9

Коэффициент ва­риации предыду­щего показателя

Е

И

120 %

-

56 %

-

109 %

-

126 %

132 %

129 %

132 %

112 %

118 %

Медиана числа ооцист у всех особей

Е

И

2

0

0

0

2

0

12

0

1

0

4

0

Медиана числа ооцист у зара­женных особей

Е

И

7

1

1

1

11

1

17

1

6

2

9

1

Максимальное число ооцист

Е

И

52

1

3

1

41

1

151

9

48

22

63

18

Обозначения: К - Способ кормления кровью (Е - естественное кровососание на доноре, И - искусственное кормление разбавленной кровью).

 

Таблица 35. Сопоставление фактической зараженности комаров с ее теоре­тическим ожиданием.

Серия

и

опыт

К

 

n

 

Найдено

ооцист

всего

Вероятность

незаражения|

1 комара

Фактич. доля

незараженных

комаров

1-1

1-1

Е

И

165

195